подготовки и

Общая цель данной процедуры — представить метод, обеспечивающий модификацию клеток микроРНК и параллельную намагничивание клеток. Этот метод позволяет решить ключевые задачи в области регенеративной медицины, такие как генетическая инженерия клеток перед трансплантацией.

Помимо эффективной модификации клеток с помощью микроРНК, была осуществлена их модификация оксидом железа. Это может быть использовано для повышения удержания клеток в интересующей области путем приложения магнитного поля. Клеточная терапия является весьма перспективным методом лечения сердечных заболеваний; при этом существует острая необходимость в улучшении показателей удержания и выживаемости клеток.

Начните выполнение данной процедуры с подготовки культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека для создания трансфекционных комплексов, как описано в текстовом протоколе. За 48 часов до трансфекции высейте HUVECs в пластиковые многолуночные планшеты для культивирования клеток подходящего размера. Исходная плотность посева должна составлять приблизительно 13 000 клеток на квадратный сантиметр поверхности роста.

Затем приготовьте свежие наночастицы miR/полиэтиленимина/суперпарамагнитного оксида железа. Сначала разведите 2,5 пмоль микроРНК на квадратный сантиметр поверхности роста клеток в пятипроцентном растворе глюкозы до получения конечной концентрации 0,125 пмоль микроРНК на мкл. Далее разведите PEI в равном объеме пятипроцентного раствора глюкозы.

Добавьте разведенный PEI к раствору микроРНК и перемешайте полученную смесь на вортексе в течение 30 секунд. Затем инкубируйте смесь miR/PEI в течение 30 минут при комнатной температуре. Обработайте MNP ультразвуком в течение не менее 20 минут в ультразвуковой водной бане при комнатной температуре.

Затем добавьте соответствующий объем раствора MNP к готовой смеси miR/PEI. После вортексирования в течение 30 секунд инкубируйте смесь в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее по каплям добавьте подготовленную смесь miR/PEI/MNP непосредственно в культуральную среду к клеткам.

Через шесть часов после трансфекции замените эту смесь свежей культуральной средой. После анализа безопасности вектора, описанного в текстовом протоколе, подтвердите и охарактеризуйте внутриклеточную локализацию трансфекционных комплексов с помощью конфокальной и микроскопии структурированного освещения сверхвысокого разрешения. Для этого, как и прежде, высейте HUVEC на покрытые желатином стеклянные покровные стекла, помещенные в лунки 24-луночных культуральных планшетов.

Трансфецируйте клетки miR/PEI/MNP с тремя цветовыми метками и инкубируйте в течение 24 часов при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Промойте покровные стекла сначала 2% раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере, а затем только PBS. Зафиксируйте клетки путем инкубации в 4% растворе параформальдегида или PFA при 37 °C в течение 15 минут.

Промойте образцы PBS, затем окрасьте ядра DAPI согласно стандартным протоколам. После этого промойте клетки PBS трижды по 15 минут на шейкере, чтобы удалить избыток красителя. Поместите подготовленные покровные стекла на предметные стекла, используя подходящий среду для заключения препаратов, и дайте им высохнуть в течение не менее одного часа перед проведением микроскопии.

Получите изображения с использованием иммерсионного масляного объектива с увеличением 63 раза, используя настройки SIM, указанные в текстовом протоколе. Для таргетинга клеток и имитации динамических условий in vitro сначала проведите трансфекцию HUVECs в 24-луночном планшете, как описано ранее. После инкубации в течение 24 часов промойте клетки.

Затем добавьте 1x раствор EDTA, разведенный в PBS, и инкубируйте клетки в течение четырех минут при 37 °C перед сбором клеток. Центрифугируйте собранные клетки при 300 ×g в течение 10 минут. Смешайте осадок клеток, полученный из одной лунки, с 1 mL свежей культуральной среды.

Перенесите клетки в одну лунку 12-луночного планшета. Закрепите небольшой магнит в соответствующем месте с помощью клейкой ленты. Поместите культуральный планшет на шейкер и инкубируйте клеточную суспензию в течение 12 часов при 150 RPM для имитации динамических условий.

Затем промойте клетки и зафиксируйте их с помощью 4% PFA. Окрасьте ядра красителем DAPI. Зафиксируйте прикрепление клеток с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с использованием возбуждающих лазеров с длиной волны 405 и 504 нм в режиме z-стека для получения исходных данных.

Для создания изображений для анализа используйте обработку методом максимальной интенсивности проекции. Для количественного анализа магниточувствительных и нечувствительных клеток сначала проведите трансфекцию HUVEC в 24-луночном планшете. Инкубируйте клетки в течение 24 часов, после чего промойте и соберите их, как описано ранее.

Ресуспендируйте клеточный осадок, полученный из каждой лунки, в 500 microliters подогретого стерильного буфера для сортировки клеток. Нанесите клеточную суспензию на магнитную сортировочную колонку, зафиксированную с помощью прилагаемого магнита. Затем трижды промойте колонки на магните свежим буфером для сортировки клеток.

Соберите фильтрат как магнитно-неактивную фракцию. Снимите колонки с магнита и немедленно соберите магнитно-активную фракцию клеток, пропустив через колонку свежий буфер для сортировки клеток с помощью плунжера. Центрифугируйте обе фракции (Mag- и Mag+) при 300 ×g в течение 10 минут.

После ресуспендирования клеточного осадка в PBS подсчитайте количество клеток и оцените их жизнеспособность с помощью теста с исключением трипанового синего. HUVEC, выделенные из пуповин, характеризуются экспрессией эндотелиального маркера CD31 и способностью к формированию трубок на матриксе базальной мембраны. HUVEC, трансфицированные miR/PEI/MNP, поглощают меченную miR.

И их выживаемость остается неизменной спустя 24 часа после трансфекции. Кроме того, микроскопия сверхвысокого разрешения демонстрирует парануклеарную локализацию трехцветно помеченных трансфекционных комплексов. Токсичность PEI подтверждается снижением функциональности клеток, трансфецированных miR/PEI.

Важно отметить, что MNP восстанавливает свойства клеток. Клетки, модифицированные miR/PEI/MNP, не отличаются от необработанных клеток по способности к формированию трубок. Более того, эти клетки сохраняют межклеточную щелевую коммуникацию, что было выявлено методом восстановления флуоресценции после фотовыжигания.

После того как суспензия модифицированных miR/PEI/MNP клеток высевают в лунки культуральной пластины, помещенной на ротационный шейкер, клетки стремятся мигрировать и прикрепляться в области локального воздействия магнита. На репрезентативных изображениях показан рост клеток в области применения магнита и без применения магнита.

И в центре лунки для культивирования, где поток жидкости концентрировал клетки. После освоения метода трансфекция клеток может быть выполнена за два часа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как осуществлять транзиентную, но высокоэффективную модификацию эндотелиальных клеток, включая их магнетизацию.

А также то, как провести терминальную характеристику клеточного продукта. При выполнении данной процедуры важно строго соблюдать указанные значения количества высеваемых клеток, пропорций компонентов для приготовления трансфекционных комплексов, времени инкубации и этапа промывки после трансфекции. Мы с большим оптимизмом полагаем, что данный подход будет легко переносим на другие типы клеток для лечения других пораженных органов.

После выполнения данной процедуры можно провести исследования in vivo с использованием модифицированных магнетизированных клеток. Это позволит ответить на дополнительные вопросы о том, достаточно ли эффективно насыщение клеток железом для обеспечения их удержания в интересующей области, а также определить пределы обнаружения при помощи МРТ in vivo.