подготовки и In Vitro Характеристика замагниченного MIR-модифицированная эндотелиальные клетки

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы внедрить метод, обеспечивающий модификацию клетки микроРНК и параллельную намагничивание клетки. Этот метод может решить ключевые проблемы в области регенеративной медицины. Например, генная инженерия клеток перед трансплантацией.

Помимо эффективной модификации клеток с помощью микроРНК, они позволили сделать это с помощью оксида железа. Это может быть использовано для улучшения удержания клеток в интересующей стороне с помощью приложения магнитного поля. Клеточная терапия очень перспективна для лечения сердечных заболеваний, удержания гипоклеток, а также для того, чтобы выживаемость клеток срочно нуждалась в улучшении.

Начните эту процедуру с культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека в приготовлении трансфекционных комплексов, как описано в текстовом протоколе. За 48 часов до трансфекции засейте HUVEC в пластиковые клеточные культуральные лунки подходящего размера. С начальной плотностью клеток примерно 13 000 клеток на квадратный сантиметр поверхности роста.

Затем приготовьте свежие наночастицы miR/полиэтиленимена/суперпарамагнитного оксида железа. Сначала разведите 2,5 пикомола микроРНК на квадратный сантиметр поверхности роста клетки и пятипроцентный раствор глюкозы до получения конечной концентрации 0,125 пикомоле микроРНК на микролитр. Далее разведите ПЭИ в равном объеме пятипроцентного раствора глюкозы.

Добавьте разведенный ПЭИ в раствор микроРНК и перебейте полученную смесь в течение 30 секунд. Затем инкубируйте смесь miR/PEI в течение 30 минут при комнатной температуре. Обрабатывайте ультразвуком MNP не менее 20 минут на водяной бане для ультразвуковой обработки при комнатной температуре.

Затем добавьте соответствующее количество раствора MNP в готовую смесь miR/PEI. После вортекса в течение 30 секунд инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем по каплям добавьте приготовленную смесь miR/PEI/MNP непосредственно в питательную среду на клетках.

Замените эту смесь свежей питательной средой через шесть часов после трансфекции. После анализа безопасности векторов, как описано в текстовом протоколе, подтвердить и охарактеризовать внутриклеточную локализацию трансфекционных комплексов с помощью конфокальной микроскопии и микроскопии структурированного освещения сверхвысокого разрешения. Для этого засейте HUVEC на стеклянные покровные листы, покрытые желатином, помещенные в лунки 24-луночных культуральных планшетов, как и раньше.

Трансфектируйте клетки с помощью 3-цветной маркировки miR/PEI/MNP и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей пять процентов углекислого газа. Промойте крышки сначала двухпроцентным бычьим сывороточным альбумином и фосфатно-соевым буфером, а затем только PBS. Зафиксируйте клетки путем инкубации в четырехпроцентном параформальдегиде или PFA при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Промойте PBS, а затем окрашивайте ядра DAPI в соответствии со стандартными протоколами. Затем промойте клетки PBS трижды по 15 минут на шейкере, чтобы удалить излишки красителя. Поместите подготовленные защитные стекла на предметные стекла микроскопа с использованием подходящего монтажного материала и дайте предметным стеклам высохнуть не менее одного часа, прежде чем использовать их для микроскопии.

Получение изображений с помощью объектива с 63-кратным погружением в масло в настройках SIM-карты в текстовом протоколе. Для нацеливания на клетки и моделирования динамических условий in vitro сначала трансфектируйте HUVECs в 24-луночный планшет, как и раньше. После инкубации их в течение 24 часов промойте клетки.

Затем добавьте один x трип в ЭДТА, разведенный в PBS, и инкубируйте клетки в течение четырех минут при 37 градусах Цельсия перед сбором клеток. Центрифугируйте собранные клетки при 300-кратном G в течение 10 минут. Смешайте клеточную гранулу, полученную из одной лунки, с одним миллилитром свежей питательной среды.

И перенесите ячейки в одну лунку 12-луночного планшета. Закрепите небольшой магнит локально с помощью скотча. Поместите планшет для культивирования на шейкер и инкубируйте клеточную суспензию в течение 12 часов при 150 об/мин для моделирования динамических условий.

Затем промойте клетки и зафиксируйте их с помощью четырехпроцентного PFA. Окрашиваем ядра DAPI. Запишите прикрепление клетки с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с 405 и 504 лазерами подросткового нанометрового возбуждения в режиме z-стека для получения исходных данных.

Используйте обработку проекционных изображений максимальной интенсивности для создания изображений для анализа. Для количественного анализа магниточувствительных и нечувствительных клеток сначала трансфектируют HUVEC в 24-луночный планшет. Инкубируйте клетки в течение 24 часов перед промывкой и сбором клеток, как описано выше.

Повторно суспендируйте клеточную гранулу, полученную из каждой лунки, с 500 микролитрами подогретого стерильного буфера для сортировки клеток. Приложите суспензию к магнитной сортировочной колонке, закрепленной прилагаемым магнитом. Затем трижды промыть колонки на магните свежим буфером для сортировки ячеек.

Соберите проточный поток в виде магнитно-нечувствительной фракции. Снимите колонки с магнита и сразу же соберите магнитно-чувствительную фракцию клетки, надавливая на свежую ячейку сортировочного буфера с помощью поршня. Центрифугируйте фракции Mag и Mag + в 300 раз больше G в течение 10 минут.

После повторного суспендирования клеточной гранулы в PBS подсчитайте клетки и оцените жизнеспособность клеток с помощью теста исключения трипанового синего. Выделенные из пуповины, HUVEC характеризуются экспрессией эндотелиального маркера CD31 и образованием трубок на матриксе базальной мембраны. Все HUVECs, трансфицированные miR/PEI/MNP, поглощают помеченные miR.

И их выживаемость остается неизменной в течение 24 часов после трансфекции. Кроме того, микроскопия сверхвысокого разрешения показывает парануклеарную локализацию 3-цветных меченых трансфекционных комплексов. Токсичность ПЭИ подтверждается снижением функциональности трансфицированных клеток miR/PEI.

Важно отметить, что MNP восстанавливает свойства клеток. Модифицированные miR/PEI/MNP клетки не отличаются от необработанных клеток с точки зрения образования трубок. Кроме того, эти клетки поддерживают межклеточную щелевую коммуникацию, что проявляется в восстановлении флуоресценции после фотообесцвечивания.

После того, как суспензия модифицированных miR/PEI/MNP клеток засеивается в лунки культуральной пластины, размещенной на вращающемся шейкере, клетки имеют тенденцию мигрировать и прикрепляться в области применения локального магнита. Репрезентативные изображения показывают рост клеток в области с применением магнита. Без применения магнита.

А в центре культуры находится колодец, где происходит концентрация жидкости с клетками. После освоения клеточная трансфекция может быть выполнена за два часа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться очень хорошее впечатление о том, как преходяще, но очень эффективно модифицировать эндотелиальные клетки, включая намагниченность.

А также как окончательно охарактеризовать клеточный продукт. При попытке выполнить эту процедуру важно следить за заданными значениями количества компонентов для приготовления трансфекционных комплексов, времени инкубации и стадии промывки после трансфекции. Мы очень оптимистично настроены в отношении того, что этот подход будет хорошо передаваться другим типам клеток для лечения других пораженных органов.

После этой процедуры могут быть проведены исследования in vivo с модифицированными намагниченными клетками. Они могли бы ответить на дополнительные вопросы, является ли загрузка элементов железом для обеспечения их удержания в интересующей стороне. А также определить пределы обнаружения с помощью МРТ in vivo.