Рекомбинантная экспрессия белков, кристаллизация и биофизические исследования Bacillus -содержащая нуклеотидная пирофосфорилаза, BcMazG

Общая цель этой процедуры заключается в получении рекомбинантного белка из непатогенных бактерий для облегчения биофизических химических исследований, таких как рентгеновская кристаллография белка или ферментативная кинетика. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как получить рекомбинантный белок, представляющий интерес, с использованием непатогенных бактерий для предварительной биофизической характеристики. Основное преимущество этого метода заключается в том, что биофизическая характеристика интересующего белка может быть выполнена в любой лаборатории, оснащенной обычными инструментами, такими как инкубаторы для клеточных культур и спектрофотометры.

Чтобы начать эту процедуру, подготовьте реакцию лигирования, как указано в текстовом протоколе. Пипеткой внесите три микролитра приготовленной реакции лигирования в пробирку, содержащую 50 микролитров химически компетентных альфа-клеток E.coli DH5. С помощью пипетки аккуратно перемешайте раствор.

Залейте раствор льдом в течение 30 минут. Далее тепловой шок в течение 45 секунд при температуре 42 градуса по Цельсию. После этого добавьте один миллилитр среды LB и наращивайте клетки, энергично встряхивая со скоростью 250 оборотов в минуту, при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут.

Нанесите 100 микролитров трансформированных клеток на шнековую пластину LB с добавлением канамицина 100 микрограммов на миллилитр. Инкубировать в течение 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия. С помощью стерильного наконечника выберите колонии из тарелки.

Выращивайте клетки в трех миллилитрах дополненной среды LB с энергичным встряхиванием со скоростью 250 оборотов в минуту при температуре 18 градусов Цельсия в течение 18 часов. Затем подготовьте ДНК плазмы и подтвердите последовательность нуклеотидов, как указано в текстовом протоколе. После ретрансформации штамма E.coli BL21 выбирают колонию с помощью стерильного наконечника и инокулируют 10 миллилитров среды LB, содержащей 150 микрограммов на миллилитр канамицина.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18 часов с энергичным встряхиванием со скоростью 250 оборотов в минуту. Далее переведите 10 миллилитров ночной культуры в один литр ЛБ и канамициновую среду. Растите при температуре 37 градусов Цельсия, пока оптическая плотность на 600 нанометрах не достигнет 0,7.

Затем погрузите культуру в ледяную воду на 15 минут. Добавьте ИПТГ в культуру так, чтобы конечная концентрация составила один миллимоляр. Инкубируйте при температуре 18 градусов Цельсия еще от 16 до 18 часов.

После этого центрифугируйте при температуре 5 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах PBS, содержащем 10 миллимоляров имидазола.

Затем дважды лизируйте клетки на льду, как подробно описано в текстовом протоколе. Центрифугируйте при 25 000 умноженных на G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы очистить клеточный лизат. Затем смешайте три миллилитра никелевых шариков и 47 миллилитров PBS, содержащего 10 миллимоляров имидазола, в 50-миллилитровой конической пробирке.

Гравитационный поток дополнительного буфера для осаждения уравновешенных шариков в стеклянной хроматографической колонке размером 2,5 на 10 сантиметров. С помощью пипетки перенесите надосадочную жидкость в колонку. Инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов на вращающемся колесе со скоростью 20 оборотов в минуту.

После этого дайте надосадочной жидкости стечь под действием силы тяжести. Промойте никелевые бусины три раза, используя 100 миллилитров PBS, содержащих 10 миллимоляров имидазола, для каждой стирки. Затем нанесите пять миллилитров PBS, содержащих 250 миллимолярных имидазолов, чтобы вымыть белок RBC 1531.

Проанализируйте 15 микролитров элюирования через SDS Page, как указано в текстовом протоколе. Пипеткой собранные фракции заведите в диализную трубку. Поместите трубку в стакан, содержащий четыре литра буфера, совместимого с расщеплением тромбина, при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.

На следующий день с помощью пипетки перенесите фракции в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Измерьте поглощение на 280 нанометрах, чтобы оценить концентрацию белка, как указано в текстовом протоколе. Далее перелейте 50 микролитров белка RBC 1531 в несколько пробирок.

Добавьте разное количество тромбина в каждую пробирку и инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия в течение трех часов. После определения наименьшего необходимого количества тромбина добавьте 10 миллиграммов белка и 60 единиц тромбина в 15 миллилитровую трубку. Выдерживать при температуре 20 градусов Цельсия в течение трех часов.

Далее перенесите переваренный тромбином белок в центробежную фильтровальную трубку. Центрифугируйте при 3000 G при четырех градусах Цельсия, чтобы уменьшить объем до менее чем пяти миллилитров. После этого нанесите концентрированный белок на подготовленную по размеру колонку эксклюзионной хроматографии.

Соберите 60 элюированных фракций по 0,5 миллилитра на тюбик. Внесите по 15 микролитров каждой фракции в 15%-ный гель SDS Page, как указано в текстовом протоколе. Затем соедините фракции, содержащие белок RBC 1531.

Для начала переложите объединенные фракции в центробежную фильтрующую трубку. Центрифугируйте при 3000 G при четырех градусах Цельсия, чтобы сконцентрировать белок примерно до 18,5 миллиграммов на миллилитр. Затем добавьте по 50 микролитров каждого кристаллизационного просеивающего раствора в лунки 96-луночной кристаллизационной пластины.

Добавьте 0,5 микролитра концентрированного белкового раствора на сидячую кровать. Отдельно смешайте белковый раствор с 0,5 микролитрами луночного раствора. Накройте тарелку прозрачной клейкой пленкой.

Инкубируйте при температуре 18 градусов Цельсия и дайте возможность диффузии пара. Используя световой микроскоп, сканируйте капли с увеличением от 20 до 40 раз, чтобы ежедневно контролировать образование кристаллов в течение двух-трех недель. После приготовления субстратов NTP добавьте каждый в 96-луночный планшет.

Добавьте 20 микрограммов белка RBC 1531 в каждую лунку с помощью пипетки для перемешивания. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После этого поместите планшет на водяную баню с температурой 70 градусов Цельсия на 15 минут, чтобы остановить каталитические реакции, опосредованные эритроцитами 1531.

Далее добавьте по одному микролитру неорганической пирофосфатазы S.cerevisiae в каждую лунку. Выдерживать при температуре 20 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем добавьте 16 микролитров раствора молибдатной кислоты в реакционную пластину для раскрытия цвета.

Через 15 минут считайте оптическую плотность на 690 нанометрах. В данном исследовании на молекулярном уровне охарактеризован белковый продукт гена B-serious BC1531. После очистки с помощью хроматографии сродства никеля проводится след расщепления тромбина.

0,3 единицы тромбина являются наименьшим количеством, необходимым для полного удаления аффинити-метки из эритроцитов 1531. После расщепления белок без меток очищается примерно до 99% чистоты с помощью эксклюзионной хроматографии. Затем олигомерный статус оценивается с помощью эксклюзионной хроматографии

Поскольку эритроцит 1531 элюируется примерно на 84 миллилитрах, его молекулярная масса оценивается в 55 килодальтон. Расчетная молекулярная масса мономера составляет около 13 килодальтон. Таким образом, RBC 1531 собирается как тетрамер.

Затем выполняется кристаллизационное экранирование с использованием метода диффузии пара сидячей каплей. Кристаллы видны через два дня при использовании одного моляра цитрата натрия и 20% полиэтиленгликоля 3000, а также при использовании 0,1 моляра какодилата натрия и одного моляра цитрата натрия. После этого определяется активность NTPase.

После добавления молибдата в реакцию гидролиза, опосредованную эритроцитом 1531, видимого изменения цвета не наблюдается. Однако при добавлении пирофсфатазы цвет меняется на темно-синий. Оптическая плотность на глубине 690 нанометров и концентрация NTP затем анализируются с помощью нелинейной регрессии.

Установлено, что фермент RBC 1531 имеет максимальную скорость 0,75 и постоянную Михаэлиса, равную 10 микромолярам. При выполнении этой процедуры важно как можно скорее подготовить образцы белков и отбросить фракции, содержащие примеси, препятствующие кристаллизации белка или вносящие ошибки в ферментативные анализы. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области энзимологии и других наук о белках, чтобы характеризовать интересующие их белки с помощью спектрофотометров, которые украшают в большинстве лабораторий.

Хотя этот метод может дать представление об общих идеях получения рекомбинантных белков, кристаллизационных экранов и ферментативной кинетики, он также может быть применен к биофизическому химическому анализу других белков, представляющих наш интерес. Не забывайте быть осторожными при работе с белками, так как они могут быть крайне нестабильными. Желательно соблюдать такие меры предосторожности, как оставление образцов на льду и хранение в холодильнике при температуре 80 градусов для длительного хранения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить рекомбинантный белок из непатогенных бактерий для получения кристаллов белка для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии и как охарактеризовать ферментативную активность колориметрическим методом.