Подготовка и характеристика новых HDL-имитирующих наночастиц для инкапсуляции фактора роста нервов

Общая цель данной статьи — представить методы приготовления и характеристики наночастиц, имитирующих липопротеины высокой плотности и нагруженных фактором роста нервов. Для приготовления обычных наночастиц, имитирующих липопротеины высокой плотности, использовалась простая гомогенизация. Эта процедура проста и масштабируема.

Более того, наночастицы значительно повысили эффективность включения, а также NGF и APOA1 в наночастицы. Были преодолены различные трудности при характеристике наночастиц, включая отделение несвязанного NGF от наночастиц с NGF, проведение достоверных исследований радиуса in vitro и анализ биодоступности наночастиц с NGF. Для начала смешайте 10 µL NGF с 10 µL протомина USP в микроцентрифужной пробирке объемом 1.5 mL и выдержите смесь в течение 10 минут при комнатной температуре для формирования комплекса.

Затем добавьте в стеклянный флакон 59 µL фосфатидилхолина и 11 µL сфингомиелина. Также добавьте 4 µL фосфатидилсерина, 15 µL холестерилолеата и 45 µL токоферилполиэтиленгликольсукцината. Перемешайте и выпарите этанол под слабым током азота в течение примерно пяти минут.

Все вспомогательные вещества должны образовать тонкую маслянистую пленку на дне стеклянного флакона. Добавьте во флакон один миллилитр ультрачистой воды и гомогенизируйте при 9 500 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре для получения прототипа наночастиц (НЧ). Затем добавьте приготовленный комплекс к прототипу НЧ.

Инкубируйте суспензию при 37 °C в течение 30 минут при перемешивании с помощью небольшого магнитного стержневого перемешивателя в стеклянном флаконе. Охладите НП, перемешивая их при комнатной температуре еще в течение 30 минут. После охлаждения добавьте 106 µL аполипопротеина A-1 и перемешивайте при комнатной температуре в течение ночи для формирования конечных НП, имитирующих HDL NGF.

Измерьте размер частиц и дзета-потенциал с помощью анализатора частиц в соответствии с инструкциями производителя. Для отделения несвязанного NGF от наночастиц, имитирующих ЛПВП с NGF, и определения эффективности включения NGF используется сшитая гель-фильтрационная хроматографическая колонка. Для подготовки колонки перенесите 15 миллилитров суспензии sepharose 4B CL в стакан объемом 50 миллилитров.

Перемешайте суспензию гранул и перелейте часть ее в колонку. Осторожно постучите по колонке, чтобы удалить пузырьки воздуха. Подождите несколько минут, пока растворитель стечет, а гранулы осядут.

Продолжайте добавлять оставшуюся суспензию. Промойте внутреннюю стенку колонки, чтобы очистить сорбент. Слейте растворитель до тех пор, пока его уровень не окажется чуть выше верхней границы неподвижной фазы.

Затем промойте и кондиционируйте колонку 20 миллилитрами 1X фосфатно-солевого буферного раствора. Для измерения эффективности включения NGF нанесите на колонку 200 микролитров NPs, имитирующих HDL-NGF, и проведите элюцию с помощью 1X PBS. Как и ранее, соберите в общей сложности 12 фракций по один миллилитр.

Подготовьте восемь диализных трубок согласно инструкциям производителя. Добавьте 30 миллилитров среды для высвобождения в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Затем нагрейте ее до 37 °C в шейкере при скорости встряхивания 135 rpm.

Закройте диализную трубку и поместите ее в среду для высвобождения. Быстро отберите 100 µL среды для высвобождения извне диализной трубки в качестве образца для нулевого момента времени. Немедленно поместите образец при температуре -20 °C для последующего анализа.

Добавьте 100 µL свежей среды для высвобождения в центрифужную пробирку, чтобы заменить отобранную пробу. Затем запустите таймер. Через 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 и 72 часа отбирайте по 100 µL среды для высвобождения, заменяя её 100 µL свежей среды.

Немедленно поместите отобранные образцы при температуре -20 °C для последующего анализа. После трехминутной гомогенизации были получены наночастицы прототипа с однородным размером. Конечные наночастицы NGF имели размер 170 nm с узким и монодисперсным распределением по размерам.

Незагруженный NGF и наночастицы были полностью разделены на колонке для гель-фильтрации. Наночастицы вымывались во фракциях со второй по четвертую. Измерения методом ELISA показали, что свободный NGF вымывался во фракциях с 7 по 10.

Рассчитанная эффективность инкапсуляции NGF составила приблизительно 66%. Здесь показано высвобождение наночастиц NGF in vitro. При добавлении PBS и BSA в среду для высвобождения свободный NGF проходил через диализную мембрану с выходом более 85%. Напротив, наночастицы NGF демонстрировали профиль медленного высвобождения: за 72 часа из наночастиц выделилось около 10% NGF. Наночастицы NGF стимулировали рост нейритов в клетках PC12 в степени, аналогичной действию свободного NGF.

При дозировке 50 нанограмм на миллилитр рост нейритов отчетливо наблюдался под микроскопом в обеих группах. Наночастицы NGF значительно повысили концентрацию NGF в плазме и снизили его захват печенью, почками и селезенкой мышей. Наночастицы, имитирующие HDL, способствовали стабилизации NGF, обеспечивая длительный период полувыведения и стабильность in vivo.

При должном навыке монодисперсные наночастицы можно подготовить за три минуты с помощью метода гомогенизации при условии правильного выполнения процедуры. При выполнении данного протокола важно помнить о необходимости использовать слабый поток азота для испарения растворителя и убедиться, что после гомогенизации на стенках контейнера не осталось липидных остатков. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как создавать наночастицы, имитирующие HDL, методом гомогенизации, и как характеризовать наночастицы, нагруженные NGF.