Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Общая цель выделения липидных капель для количественной масс-спектрометрии заключается в понимании функции этих органелл, например, в репликации патогенов, таких как вирус гепатита С. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области инфекционных заболеваний, например, почему патогены связываются с каплями для репликации. Выделение липидных капель может быть выполнено за шесть-семь часов.

И во время этой процедуры важно не допустить загрязнения кератином. Для начала выньте по 50 миллилитров из каждой бутылки среды DMEM и добавьте 50 миллилитров диализированной сыворотки теленка плода. Далее растворите 50 миллиграммов углерода 13 меченого лизина и 50 миллиграммов углерода 13 меченного аргинина в одном миллилитре среды.

Тщательно перемешайте и добавьте аминокислоты в среду DMEM plus FCS. Затем добавьте PenStrep и заменитель глютамина. Стерильно отфильтруйте среду с помощью фильтра 0,45 микрона и пометьте бутылку как тяжелую среду SILAC.

Чтобы приготовить светлую среду, повторите эти действия, используя 50 миллиграммов аргинина и 50 миллиграммов лизина. Маркируйте флакон как светлый SILAC medium. Трипсинизируйте клетки и разделите на две лунки шестилуночный культуральный планшет.

Одна лунка должна содержать два миллилитра тяжелой среды SILAC, а другая – два миллилитра легкой среды SILAC. Культивируйте клетки не менее шести пассажей. После шести пассажей включение тяжелых аминокислот должно составлять более 95%.Соберите один миллион клеток из популяций тяжелых и легких меченых клеток для анализа эффективности включения.

После промывки клеток в 1X PBS гранулируйте их центрифугированием в течение пяти минут при 160 g и четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте клеточные гранулы в 150 микролитрах MS-буфера. Далее инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут.

Затем лизируйте клетки с помощью ультразвука при четырех градусах Цельсия. Удалите остатки клеток центрифугированием в течение 10 минут при 11 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и определите концентрацию белка с помощью анализа белка, совместимого с детергентом.

Затем смешайте 75 микрограммов белка с шестью образцами буфера. После кипячения при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут отделите белки с помощью SDS-PAGE в буфере SDS при 180 болтах в течение примерно одного часа. После окрашивания Кумасси удалите ту же полосу белка и проанализируйте эффективность включения с помощью анализа на рассеянный склероз.

Заражайте легкую популяцию клеток репортерным вирусом гепатита С, инкубируя их с волокнистыми запасами в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия. Размножите инфицированные ВГС легкие клетки и неинфицированные тяжелые клетки, как описано в текстовом протоколе. При использовании штамма ВГС, несущего ген устойчивости к бластицидину, добавьте 10 мкг на миллилитр бластицидина S в легкую среду для отбора ВГС-положительных клеток.

За сутки до выделения липидных капель промойте клетки PBS, триспинизируйте и повторно суспендируйте в соответствующей легкой или тяжелой среде. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры Нейбауэра. Затем посадите семь миллионов клеток каждой популяции в чашку для клеточной культуры площадью 150 квадратных сантиметров.

Приготовьте не менее пяти блюд на легкую и тяжелую популяцию клеток. Культивируйте клетки по 30 миллилитров среды на чашку в течение ночи. На следующий день удалите среду, и промойте клетки в 1X PBS.

Отсоедините ячейки в 1X PBS с помощью скребка ячеек. После подсчета обеих популяций клеток, как и раньше, извлеките одинаковое количество клеток в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров. Гранулируйте клетки центрифугированием в течение пяти минут при 160 g и четырех градусах Цельсия.

Удалите PBS и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре сахарозного буфера. Перенесите клеточную суспензию в плотно прилегающий гомогенизатор Ounce перед лизисом клеток с помощью 200 ударов по льду. Затем перенесите лизат в микрофугу объемом 1,5 миллилитра и вращайте ядра и клеточные остатки в течение 10 минут при температуре 1000 g и четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования храните аликвоту в объеме 25 микролитров постядерной фракции, или ПНС, при температуре минус 20 градусов Цельсия в качестве входного контроля. Поместите оставшуюся фракцию ПНС на дно пробирки центрифуги и посыпьте примерно тремя миллилитрами буфера для промывки липидных капель. Центрифугируйте в течение двух часов при 100, 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования соберите плавающую фракцию липидных капель с верхней части пробирки с помощью изогнутой тупой канюли. Затем поместите фракцию липидных капель в центрифужную пробирку, наложите буфер для промывки липидных капель и повторите этап центрифугирования. Сбор липидных капель с вершины градиента требует опыта.

И тем легче, чем больше дробь. Можно использовать жировые клетки для практики. Или вы можете кормить свои клетки олеатом, чтобы увеличить количество липидных капель.

Еще раз соберите плавающую фракцию липидной капли с помощью изогнутой тупой канюли из верхней части пробирки. Перенесите липидные капли в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 500 микролитров буфера для промывки липидных капель. Затем вращайте образец в течение 20 минут при температуре 21 000 g и четырех градусах Цельсия.

Снимите расположенный ниже буфер для промывки с помощью наконечника пипетки с гелевым наполнителем и повторите этап промывки три раза. После окончательного удаления промывочного буфера смешайте пять микролитров фракций липидных капель с 10 микролитрами буфера для лизиса NP 40 для определения содержания белка. Инкубируйте образец на льду в течение одного часа, чтобы инактивировать вирус при работе с инфекционным материалом.

На этом этапе фракции липидных капель могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия. Затем смешайте объем, который соответствует не менее 35 микрограммам белка с 4-кратным загрузочным красителем. Инкубируйте смесь на льду в течение одного часа, чтобы инактивировать вирус при работе с инфекционным материалом.

Прокипятите образец при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем выполните SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси для подготовки образца для жидкостной хроматогрофии пары с тандемной масс-спектромией, как описано в текстовом протоколе. Для анализа чистоты липидных капель разбавляют аликвоты фракций липидных капель, от одной до двух, буфером для лизиса NP 40.

Разбавляют входные контрольные доли от одной до десяти тем же буфером. Инкубируйте образцы на льду в течение одного часа, чтобы инактивировать вирус при работе с инфекционным материалом. Затем определите уровень белка с помощью анализа белка, совместимого с детергентом.

Затем смешайте равное количество белка с 6-кратным буфером для образцов и инкубируйте образцы на льду в течение одного часа, чтобы инактивировать вирус при работе с инфекционным материалом. Наконец, продолжайте использовать SDS-PAGE и перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану путем промокания резервуара при напряжении 80 вольт в течение 90 минут. Здесь представлен репрезентативный вестерн-блоттинг постъядерных и липидных фракций в каплях.

Вестерн-блоттинг отчетливо показывает обогащение маркерами липидных капель белков перилипина 2 и перилипина 3 в липидных дроплетных фракциях, а также истощение маркеров других клеточных компартментов. Постядерные фракции и фракции липидных капель могут быть дополнительно проанализированы с помощью окрашивания синим и серебряным цветом Кумасси. Эта тепловая карта иллюстрирует количество пептидов и процент белкового покрытия белков, идентифицированных в фракциях липидных капель анализируемых клеток.

Окончательная тепловая карта показывает, как инфекция ВГС изменяет количество липидных капель в сутки. Красным цветом обозначены обогащенные липидные каплевые белки, а синим — обедненные липидные капли-ассоциированные белки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы смешиваем клетки до выделения и предварительного выделения липидных капель, и таким образом мы можем свести к минимуму ошибки, которые могут произойти во время лизиса клеток и на этапах выделения.