Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Общая цель выделения липидных капель для количественной масс-спектрометрии заключается в изучении функций этих органелл, например, при репликации таких патогенов, как вирус гепатита C. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области инфекционных заболеваний, например, почему патогены связываются с каплями для репликации. Процесс выделения липидных капель занимает от шести до семи часов.

В ходе этой процедуры важно избегать загрязнения кератином. Для начала отберите по 50 мл из каждого флакона среды DMEM и добавьте 50 мл диализованной сыворотки теленка. Затем растворите 50 мг лизина, меченного углеродом 13, и 50 мг аргинина, меченного углеродом 13, в 1 мл среды.

Тщательно перемешайте и добавьте аминокислоты в среду DMEM с добавлением FCS. Затем добавьте PenStrep и заменитель глутамина. Профильтруйте среду через стерильный фильтр с размером пор 0,45 мкм и подпишите флакон как среда для тяжелого SILAC.

Для приготовления «легкой» среды повторите эти шаги, используя 50 milligrams аргинина и 50 milligrams лизина. Маркируйте флакон как «легкая среда SILAC». Проведите трипсинизацию клеток и распределите их по двум лункам шестилуночного культурального планшета.

В одну лунку следует добавить два миллилитра тяжелой среды SILAC, а в другую — два миллилитра легкой среды SILAC. Культивируйте клетки в течение как минимум шести пассажей. После шести пассажей степень включения тяжелых аминокислот должна превышать 95%. Соберите один миллион клеток из популяций с тяжелой и легкой метками для анализа эффективности включения.

После промывки клеток в 1X PBS осадите их центрифугированием в течение пяти минут при 160 ×g и четырех градусах Celsius. Ресуспендируйте клеточный осадок в 150 µL MS-буфера. Затем инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут.

Затем лизируйте клетки с помощью соникации при температуре 4 °C. Удалите клеточный дебрис путем центрифугирования в течение 10 минут при 11 000 ×g и 4 °C. Перенесите супернатант в новую пробирку и определите концентрацию белка с помощью метода анализа белка, совместимого с детергентами.

Затем смешайте 75 µg белка с 6х буфером для образцов. После кипячения при 95 °C в течение пяти минут разделите белки методом SDS-PAGE в электрофоретическом буфере для SDS при 180 В в течение примерно одного часа. После окрашивания кумасси вырежьте соответствующую полосу белка и проанализируйте эффективность включения с помощью масс-спектрометрии (MS).

Заинфицируйте популяцию «легких» клеток репортерным вирусом гепатита C, инкубируя их с фиброзными стоками в течение четырех часов при 37 °C. Проведите экспансию инфицированных HCV «легких» клеток и неинфицированных «тяжелых» клеток, как описано в текстовом протоколе. При использовании штамма HCV, несущего ген устойчивости к бластицидину, добавьте 10 мкг/мл бластицидина S в среду для «легких» клеток для селекции HCV-положительных клеток.

За один день до выделения липидных капель промойте клетки PBS, обработайте трипсином и ресуспендируйте в соответствующей легкой или тяжелой среде. Подсчитайте количество клеток с помощью камеры Горяева (камеры Нойбауэра). Затем высейте по семь миллионов клеток каждой популяции в чашку для культивирования клеток площадью 150 квадратных сантиметров.

Подготовьте не менее пяти чашек для каждой популяции легких и тяжелых клеток. Культивируйте клетки в 30 миллилитрах среды на одну чашку в течение ночи. На следующий день удалите среду и промойте клетки 1X PBS.

Отделите клетки в 1X PBS с помощью скребка для клеток. После подсчета обеих популяций клеток, как и прежде, перенесите равное количество клеток в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитра. Осадите клетки путем центрифугирования в течение пяти минут при 160 ×g и четырех градусах Цельсия.

Удалите PBS и повторно суспендируйте осадок клеток в одном миллилитре сахарозного буфера. Перенесите клеточную суспензию в плотно прилегающий гомогенизатор Ounce, после чего проведите лизис клеток, совершив 200 движений на льду. Затем перенесите лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и осадите ядра и клеточный дебрис центрифугированием в течение 10 минут при 1 000 ×g и четырех градусах Celsius.

После центрифугирования stored аликвоту постнуклеарной фракции (PNS) объемом 25 µL при температуре -20 °C в качестве контрольного образца (input control). Оставшуюся часть фракции PNS поместите на дно центрифужной пробирки и аккуратно наслоите сверху примерно 3 mL буфера для промывки липидных капель. Центрифугируйте в течение двух часов при 100 000 ×g и температуре 4 °C.

После центрифугирования соберите плавающую фракцию липидных капель с верхней части пробирки с помощью изогнутой тупой канюли. Затем перенесите фракцию липидных капель в центрифужную пробирку, добавьте поверх буфер для промывки липидных капель и повторите этап центрифугирования. Сбор липидных капель с верхней части градиента требует определенного навыка.

Причем чем больше фракция, тем проще выполнить процедуру. Для практики можно использовать жировые клетки. Также можно добавить в среду для культивирования клеток олеат, чтобы увеличить количество липидных капель.

Снова соберите плавающую фракцию липидных капель с поверхности пробирки с помощью изогнутой тупоконечной канюли. Перенесите липидные капли в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliter и добавьте 500 microliters буфера для промывки липидных капель. Затем центрифугируйте образец в течение 20 минут при 21, 000 ×g и температуре four degrees Celsius.

Удалите остатки промывочного буфера с помощью наконечника пипетки для нанесения образцов на гель и повторите этап промывки три раза. После окончательного удаления промывочного буфера смешайте 5 µL фракций липидных капель с 10 µL лизис-буфера NP 40 для определения содержания белка. Если работа ведется с инфекционным материалом, инкубируйте образец на льду в течение одного часа для инактивации вируса.

На данном этапе фракции липидных капель можно хранить при температуре -20 °C. Затем смешайте объем, соответствующий как минимум 35 µg белка, с 4x буфером для нанесения образцов. Если работа ведется с инфекционным материалом, выдержите смесь на льду в течение одного часа для инактивации вируса.

Кипятите образец при 95 °C в течение пяти минут. Затем проведите SDS-PAGE с последующим окрашиванием кумазином для подготовки образца к жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, как описано в текстовом протоколе. Для анализа чистоты липидных капель разведите аликвоты фракций липидных капель в соотношении от 1:2 с лизирующим буфером NP 40.

Разведите исходные контрольные фракции в десять раз тем же буфером. При работе с инфекционным материалом инкубируйте образцы на льду в течение одного часа для инактивации вируса. Затем определите уровень белка с помощью метода анализа белка, совместимого с детергентами.

Затем смешайте равные количества белка с 6x буфером для образцов и инкубируйте образцы на льду в течение одного часа для инактивации вируса, если работа ведется с инфекционным материалом. Наконец, проведите SDS-PAGE и перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану методом танкового блоттинга при 80 вольтах в течение 90 минут. Здесь представлен репрезентативный результат вестерн-блот-анализа постнуклеарных фракций и фракций липидных капель.

Вестерн-блот четко демонстрирует обогащение фракций липидных капель белками-маркерами перилипином 2 и перилипином 3, а также отсутствие маркеров других клеточных компартментов. Пост-ядерные фракции и фракции липидных капель могут быть дополнительно проанализированы с помощью окрашивания кумасси синим и серебром. Данная тепловая карта иллюстрирует количество пептидов и процент покрытия белков, идентифицированных во фракциях липидных капель анализируемых клеток.

Итоговая тепловая карта демонстрирует, как инфекция HCV изменяет состав липидных капель в сутки. Белки, ассоциированные с липидными каплями, содержание которых увеличилось, отмечены красным цветом, а белки с уменьшенным содержанием — синим. Основным преимуществом данного метода является то, что мы смешиваем клетки перед их выделением и перед выделением липидных капель, что позволяет минимизировать ошибки, которые могут возникнуть на этапах лизиса клеток и выделения.