Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

Общая цель этого метода заключается в генотипировании мутантных клонов CRISPR/Cas9, индуцированных делецией инсерции, с высокой пропускной способностью. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетики, такие как фенотипический эффект нокаутирования определенного гена в модели выбора SAIL. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает многогибкое грохочение с минимальной или высокой пропускной способностью.

Хотя этот метод может дать представление о генетике рака человека, он также может быть применен к другим системам, таким как человеческая, стволовая и первичная клетки, или клетки нечеловеческого происхождения. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы проводили короткие тандемные повторы или анализы STR-типирования. Чтобы начать процедуру, трансфицируйте выбранные клетки плазмидой, экспрессирующей флуоресцентную метку cas9 и одну направляющую РНК.

Трипсинизируйте клетки и выберите около 3500 флуоресцентно меченых клонов. Разложите клоны порциями по 500, 1000 и 2000 клеток на 10-сантиметровую посуду в восьми миллилитрах пенициллина стрептомицина, дополненной питательной средой. Инкубируйте клетки в атмосфере с 5%-ным содержанием CO2 при температуре 37 градусов Цельсия, заменяя среду каждые пять дней, пока колонии отдельных клеток не станут видны невооруженным глазом.

Затем аспирируйте отдельные колонии в пипетку объемом 200 микролитров с примерно пятью микролитрами питательной среды. Переложите каждую колонию в отдельную лунку, содержащую 200 микролитров питательной среды. Многократно пипетируйте каждую смесь вверх и вниз, чтобы снова суспендировать клетки.

Инкубируйте клетки в описанных выше условиях до тех пор, пока клетки не достигнут конфлюенции от 50 до 90%. Удалите из лунок излишки питательной среды, и добавьте в каждую лунку по 25 микролитров 0,05%-ного трипсина ЭДТА без фенолового красного. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 7 минут.

Затем многократно пипетируйте смеси вверх и вниз, чтобы снова суспендировать трипсинизированные клетки. Осмотрите лунки под микроскопом, чтобы убедиться, что ячейки оторвались от стенок лунки. Чтобы получить реплики отдельных клонов, перенесите пять микролитров каждой клеточной суспензии в пустую 96-луночную культуральную тарелку.

В каждую лунку добавьте по 200 микролитров питательной среды. Затем загрузите в лунки пустой 96-луночный ПЦР-планшет 10 микролитров буфера для лизиса. Перенесите еще по пять микролитров каждой клеточной суспензии на эту 96-луночную пластину.

Кратковременно центрифугируйте пластину до тех пор, пока жидкость не осядет на дне лунок. Добавьте 200 микролитров питательной среды к оставшимся 15 микролитрам каждой клеточной суспензии. Храните оригинальную суспензию и реплики в условиях инкубации для последующей проверки нокаутного статуса клонов.

Затем используйте термоциклирование, чтобы полностью лизировать клетки в буфере для лизиса. Кратковременно центрифугируйте лизаты. Разбавьте лизаты 40 микролитрами воды, не содержащей нуклеазы.

Сделайте вихревой и кратковременно центрифугируйте разведенные лизаты. Перед проведением флуоресцентной ПЦР спроектируйте и проверьте специфичность нескольких пар немеченых праймеров на лизированных клетках дикого типа. Определите оптимальную пару праймеров и получите меченые флуорофором прямые праймеры и немеченый обратный праймер

Обязательно проверяйте специфичность праймеров с помощью вихревых клеток, лизируйте с помощью домашнего буфера для лизиса, так как результаты могут отличаться от использования очищенной геномной ДНК. Используя меченые праймеры, проведите флуоресцентную ПЦР-реакцию объемом 20 микролитров с тремя микролитрами разведенных лизатов для амплификации целевых областей. Оцените размер и относительное количество ампликонов ПЦР, разрешив пять микролитров ампликонов в 1%-ном агарозном геле.

Чтобы начать подготовку образца, используйте воду, свободную от нуклеаз, для разбавления ампликонов дикого типа и ДНК, нацеленной на CRISPR/Cas9, до приблизительной концентрации 2,5 нанограмма на микролитр. Смешайте вместе равные объемы разбавленных образцов ДНК дикого типа и целевых образцов ДНК. Загрузите в лунки 96-луночного ПЦР-планшета девять микролитров смеси деионизированного формамида и красителя стандартного размера 29 к одному и один микролитр смешанных ампликонов.

Плотно закройте планшет и нагрейте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение трех минут с помощью термоамплификатора для ПЦР. Сразу после нагревания остудите тарелку на льду в течение трех минут. Провести капиллярный гель-электрофорез с помощью генетического анализатора.

После завершения электрофореза импортируйте данные в программное обеспечение для анализа и нанесите их на график. Проверьте качество стандарта размера, просмотрев данные в соответствующем канале красителя. Затем экспортируйте значения каналов красителя для нецелевых элементов управления дикого типа и целевых клонов в формате txt.

Из этого файла импортируйте идентификаторы красителей, имена файлов образцов, размеры фрагментов и значения высоты пиков в программное обеспечение для работы с электронными таблицами. Вычислите разницу в размере фрагмента между целевым клоном и нецелевым элементом управления диким типом в каждом образце. Определите клоны с мутациями индел, которые не кратны трем парам оснований.

Последовательно разверните выбранные клоны из сохраненных реплик. Выполните секвенирование по Сэнгеру и западный анализ крови для определения генотипов клонов и проверки нокаутного статуса клонов. Клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы HEPG2 была нацелена с помощью конструкции CRISPR/Cas9 против гена Nap1L1.

Целевые аллели дикого типа и целевые аллели CRISPR/Cas9 амплифицировали ПЦР с использованием праймеров, меченных зелеными и синими флуорофорами соответственно. Используя специально оптимизированный протокол флуоресцентной ПЦР, ампликоны целевых клонов были получены с хорошим выходом. Не наблюдалось интерференции между зелеными и синими флуоресцентными красителями в образцах отдельных клонов.

Анализ размеров фрагментов, определенных с помощью капиллярного гель-электрофореза, выявил делецию одной и 10 пар оснований из двух показанных здесь клонов. Результаты секвенирования по Сэнгеру согласуются с анализом капиллярного гель-электрофореза. Западный анализ крови подтвердил, что отобранные клоны не экспрессировали NAP1L1.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о тщательной маркировке образцов, так как в них задействовано много образцов, а также свести к минимуму время воздействия ампликона флуорофорной метки, поскольку они чувствительны к свету. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как количественная ПЦР ОТ, западный анализ крови и секвенирование по Сэнгеру, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие гены представляют интерес. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как генотипировать индуцированные CRISPR/Cas9 мутантные клоны с высокой пропускной способностью с помощью флуоресцентной ПЦР в сочетании с электрофорезом в капиллярном геле.