Хроническая аутоиммунная модель сухих глаз с увеличением клеток памяти с эффекторной памятью в ткани глазного яблока

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы вызвать клинические признаки слезной дисфункции и воспаления слезных желез у крыс с помощью подкожной иммунизации и субконъюнктивального и внутрислезного введения экстрактов слезных желез для оценки методов лечения аутоиммунного сухого глаза. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о синдроме сухого глаза, например, эффективны ли препараты, подавляющие Т-клетки при аутоиммунных заболеваниях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она вызывает признаки глазного заболевания, схожие с синдромом сухого глаза человека, а также количественно оценивает количество Т-клеток, проникающих в слезную железу и глаз.

Последствия этой животной модели распространяются на понимание транспорта лимфоцитов, поскольку можно изучать селезенку и лимфатические узлы. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности из-за отсутствия подходящих инструментов для документирования изменений в маленьком крысином глазу. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как некоторые шаги трудно освоить из-за быстрого высыхания крысиного глаза и отсутствия моргания после анестезии.

После усыпления самки крысы Спрэг Доули в соответствии с текстовым протоколом, поместите животное плашмя так, чтобы одно ухо прижалось к столу, а другим было обращено вверх. Ножницами сделайте 10-миллиметровый разрез сверху-снизу под открытым ухом. Затем удалите слезную железу, рассекая ее от окружающей соединительной ткани и от дренажного протока.

Далее с помощью ножниц измельчите ткань как можно мельче на льду. Затем добавьте 150 микролитров PBS с 1X ингибитором протеазы на слезную железу. Установив ультразвуковой аппарат на 10 секунд включения, 10 секунд выключения и амплитуду 30%, обрабатывайте образцы на льду с частотой 20 килогерц в течение пяти минут.

Затем центрифугируйте обработанные ультразвуком образцы при температуре 13 000 раз g и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Затем залейте надосадочную жидкость в 1,5 миллилитровые тубы, и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Перенесите полный адъювант Фрейнда, содержащий пять миллиграммов на миллилитр Mycobacterium tuberculosis H37Ra или неполный адъювант Фрейнда, в 50 миллилитровую пробирку, следя за тем, чтобы объем адъюванта к антигенной смеси находился в соотношении один к одному. Добавляйте антигенную смесь, содержащую два миллиграмм на миллилитр овальбумина и 10 мг на миллилитр экстракт слезной железы капля за каплей в адъювантный раствор во время вортексирования с максимальной скоростью, которая не приводит к разливу. Продолжайте вортекс в течение пяти минут после того, как весь антиген будет добавлен.

Перелейте эмульсию в пятимиллилитровый шприц, а с помощью шприцевого соединителя соедините его с другим пятимиллилитровым шприцем. Затем перетолкните эмульсию из одного шприца в другой, чтобы перемешать ее. В нулевой день распределите 200 микролитров эмульсии, которая содержит один миллиграмм экстракта слезных желез и 200 микрограммов овальбумина в полном адъюванте Фрейнда, в один миллилитр шприцев с замком Люэра и оснастите шприцы иглами 27 калибра.

Не используя анестезию, подкожно вводите эмульсию у основания крысиных хвостов. Затем, на 14 день, аналогичным образом ввести 200 микролитров того же антигена в неполный адъювант Фрейнда. В тот же день внутрибрюшинно вводят 300 нанограмм коклюшного токсина в 100 микролитрах PBS.

На 48 день взвесьте необходимое количество овальбумина и растворите его в PBS. Затем объедините овальбумин с размороженным экстрактом слезной железы, приготовленным ранее в этом видео, получив раствор антигена, содержащий один миллиграмм на миллилитр овальбумина и один миллиграмм на миллилитр экстракта слезной железы. После обезболивания крысы введите пять микролитров антигена в форницеальную субконъюнктиву глаза.

Затем введите 20 микролитров антигена в слезную железу. Во время удержания крысы под наркозом в соответствии с текстовым протоколом, чтобы измерить объем слезы феноловой красной нитью, используйте одну пару щипцов для удержания нити, а другую для оттягивания нижнего века крысы. Поместите нить в проксимальный угол нижнего свода на одну минуту, а затем снимите нить.

Затем поместите нить рядом с линейкой с миллиметровой разметкой, и сделайте изображение длины смачиваемой части нити. Чтобы измерить гладкость разрыва роговицы, поместите крысу под стереомикроскоп, оснащенный кольцевым осветителем и камерой. Затем нанесите пять микролитров физиологического раствора на роговицу крысы.

Пальцами в перчатках пассивно моргайте, двигая верхним и нижним веком примерно пять раз, чтобы распределить физиологический раствор. При увеличении в 1,6 раза сфокусируйте кольцевой осветитель на середине поверхности роговицы. Затем, через 10 секунд, получите фотографические изображения.

Используйте флуоресцеиновое сканирование для измерения повреждения роговицы, добавив два микролитра 0,2% флуоресцеина в роговицу крысы. Пальцем в перчатке пассивно откройте и закройте веки крысы три раза, чтобы распределить флуоресцеиновый краситель по поверхности глаза. Через одну минуту с помощью трехмиллилитрового шприца наберите один миллилитр физраствора.

Затем расположите шприц примерно в двух-трех миллиметрах от роговицы и аккуратно нанесите физиологический раствор на глаз. При выключенном фоновом освещении получайте изображения под кобальтово-синим фильтром окулярного микроскопа. После усыпления крысы согласно текстовому протоколу с помощью ножниц удалите верхние и нижние веки.

Освободите глазной яблоко, разорвав экстраокулярные мышцы, зрительный нерв и форнисальную конъюнктиву. Сделайте надрез, чтобы открыть глазное яблоко. Снимите линзу с стекловидным телом.

Затем поместите рассеченные глазные яблоки в пробирки объемом 1,5 миллилитра на лед. Наконец, соберите слезные железы, как описано ранее в этом видео. На этом рисунке показаны репрезентативные изображения фенольных красных нитей от контрольной группы и DED крысы.

Длина фенольных красных нитей в группе DED короче, чем в контрольной группе, что указывает на меньший объем разрыва. Флуоресцеин связывается с поврежденным эпителием роговицы и, таким образом, используется для измерения степени повреждения. В этом эксперименте пятна флуоресцеина на поверхности роговицы крыс DED были оценены от нуля до двух и сравнивались с контрольными крысами.

Крысы с ДЭД имеют более сильное окрашивание флуоресцеином, чем контрольные крысы, что указывает на повреждение роговицы. Как видно на рисунке, если поверхность роговицы гладкая с высокой устойчивостью к разрыву, изображение осветительного кольца на поверхности глаза круглое и идеальное. Искажение изображения указывает на снижение гладкости роговицы и нестабильную слезную пленку, что наблюдалось с более высокой степенью искажения в группе DED.

Этот анализ проточной цитометрии показывает, что преобладающим субпопуляцией Т-клеток в нормальных тканях глазного яблока крысы являются эффекторные Т-клетки памяти. В глазных яблоках крыс с DED примерно 70% CD3-положительных Т-клеток являются эффекторными Т-клетками памяти, в то время как у контрольных крыс это число составляет примерно 50%. Глазные яблоки крыс с DED имеют значительно более высокие эффекторные Т-клетки памяти, чем у контрольных крыс. После этой процедуры может быть выполнено окрашивание на другие виды иммунных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы.

Например, можно окрашивать на клетки врожденного иммунитета или В-лимфоциты. После своего развития этот метод проложил путь исследователям к пониманию поверхностной иммунологии глаз и, в дальнейшем, к изучению сухого глаза у человека и синдрома Шегрена. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как вызвать аутоиммунную сухость глаз у крыс, и вести надежное документирование результатов.