Хирургическая абляция Анализ для изучения Регенерации глаз в планарии

Этот протокол показывает, как последовательно акцизный планарии глаз (оптические чашки) без нарушения окружающих тканей. С помощью иглы и шприца инсулина, либо один или оба глаза могут быть абляции, чтобы облегчить расследование механизмов, регулирующих регенерацию глаз, эволюцию визуальной регенерации, а также нейронную основу светоиндуцированного поведения.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать, как надежно удалить планарийную оптическую чашу, не нарушая мозг или окружающие ткани, чтобы эта техника могла быть реализована исследователями и студентами на всех уровнях образования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации, такие как определение механизмов, регулирующих поддержание и дифференцировку эндогенных стволовых клеток глаза in vivo. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет исследователям удалять только ткани глаза с минимальным нарушением других тканей.

Как правило, требуется практика, прежде чем новички в этом методе смогут надежно удалить нужное количество ткани, удаляя весь глаз и избегая абляции окружающих тканей. Для начала выберите червей, которых не кормили в течение как минимум одной недели и которые имеют длину не менее пяти-семи миллиметров. Переложите от 15 до 30 червей в 100-миллиметровую чашку Петри, заполненную на две трети червячной водой, и немедленно установите крышку на место.

Наблюдайте за червями на предмет отсутствующих или непигментированных тканей, таких как белые головы или хвосты, чтобы убедиться, что они не повреждены и не регенерируют в последнее время. Сначала протрите рабочее место и основание препарирующего микроскопа раствором 70% этанола и дайте ему полностью высохнуть. Поставьте чашку с выбранными червячками с левой стороны от микроскопа.

Затем с правой стороны микроскопа поместите пару щипцов номер пять, инсулиновую иглу 31 калибра 5/16 дюйма с одномиллилитровым шприцем, чистую переводную пипетку и маркированную 12-луночную пластину для сбора абляционных червей. Поместите коробку с салфетками без ворса, пластиковую бутылку для мытья, наполненную свежей червячной водой, и дополнительные пипетки для переноса, чтобы они были легко доступны во время операции. Расположите пластину Пельтье в центре основания препарирующего микроскопа и установите выход на источник постоянного тока так, чтобы поверхность пластины Пельтье была достаточно холодной для обездвиживания червей.

В качестве альтернативы вместо тарелки Пельтье можно использовать чашку Петри, наполненную льдом. Чтобы подготовить операционную поверхность, сначала отрежьте кусок пластиковой парафиновой пленки размером пять на десять сантиметров и поместите его над центром пластины Пельтье. Далее сложите безворсовую салфетку в квадрат примерно в два сантиметра, и положите его поверх пленки.

Затем удерживайте сложенную салфетку на месте, смочите ее червячной водой и скатайте салфетку с помощью переводной пипетки. Наконец, отрежьте кусок белой фильтровальной бумаги размером от 1,5 до двух сантиметров в квадрате и положите его поверх салфетки. Чтобы начать операцию, поместите одного червя тыльной стороной вверх на фильтровальную бумагу с помощью переводной пипетки.

Включите свет и сфокусируйте его луч на червячке. Отрегулируйте фокус и увеличение препарирующего микроскопа так, чтобы глаза червя были хорошо видны. Поверните парафиновую пленку, чтобы отрегулировать положение червя так, чтобы его голова была направлена в сторону исследователя и наклонена под углом от 30 до 40 градусов вправо.

Если червь расположен вентральной стороной вверх и видно отверстие глотки, используйте тупую сторону щипцов, чтобы аккуратно изменить положение червя на спинную сторону вверх с видимыми глазами. Отрегулируйте настройки микроскопа так, чтобы глаза были четко сфокусированы. Также убедитесь, что глаза и окружающие ткани головы находятся в поле зрения.

Держите чистый шприц в правой руке между большим и указательным пальцами. Опорьтесь нижней частью шприца на большой палец левой руки, упираясь в пластину Пельтье. Посмотрите в микроскоп, чтобы убедиться, что скос иглы виден.

Поместите указательный палец левой руки на операционную поверхность так, чтобы он составлял угол 40 градусов большим пальцем левой руки, чтобы поверхность оставалась стабильной во время процедуры. Расположите иглу под углом 90 градусов к ушку фаской иглы вверх. Кончиком иглы аккуратно проникните в тонкий слой ткани, лежащий над зрительной чашечкой глаза, видимый как белая, непигментированная область.

Проводя справа налево, очень аккуратно удалите все черные пигментированные ткани, расположенные внутри зрительного нерва, а также все белые салфетки. Если вы выполняете двойную абляцию глаза, удалите второй глаз сейчас. После завершения операции налейте на пипетку небольшое количество червячной воды и выпустите воду на червя, чтобы оторвать его от фильтровальной бумаги.

Сразу же втяните червячка в переводную пипетку. Переместите червя на маркированную 12-луночную пластину, на две трети заполненную свежей червячной водой. Как только все черви будут перенесены, промойте их, заменив воду из колодцев свежей червячной водой.

Инкубируйте червей, защищенных от света, в инкубаторе с температурой 20 градусов по Цельсию и следите за процессом регенерации. Чтобы пожертвовать живыми червями, удалите воду червей из тарелки и замените ее на 70% этанол. Инкубируйте червей в течение трех-пяти минут и наблюдайте, не лизятся ли черви и не становятся серыми.

Здесь представлены фотографии плоских червей, подвергшихся двойной абляции глаза и абляции одного глаза, сделанные до, через четыре дня и через две недели после хирургической процедуры. Изображения демонстрируют прогресс регенерации с течением времени. Регенерация глаз у абляционных червей также была подтверждена иммуногистохимическим окрашиванием арестина и недавно разработанных фоторецепторных нейронов.

Восстановление зрительной системы у плоских червей после двойной абляции глаза также изучалось в функциональном анализе, основанном на фотофобной реакции дикого типа на свет. Через 24 часа после абляции безглазые черви не избегают света и перемещаются через световые пятна. Светобоязнь восстанавливается через семь дней после процедуры, что свидетельствует о том, что регенерированная зрительная система функционирует.

После освоения процедура двойной абляции глаза одного червя может быть выполнена примерно за три минуты. При абляции важно вырезать все пигментированные и непигментированные ткани глаза, при этом не повредить ткань между глазами и не порвать ткань позже в глаз. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как иммуногистохимия и РНК-интерференция, чтобы изучить роль конкретных генов и их регенеративный процесс.

Кроме того, могут быть проведены поведенческие анализы для проверки функции глаза после повторного роста. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как иссекать планарию глаз, не нарушая окружающие ткани. Не забывайте, что работа с иглами может быть опасной, поэтому следует соблюдать такие меры предосторожности, как ношение перчаток и удержание иглы в стороне от вас.