Использование чрезвычайных оптической передачи для количественного определения сердечного биомаркеров в сыворотке крови человека
13 декабря 2017 г.
Эта работа описывает метод литография nanoimprinting для изготовления высококачественных зондирования массивы, которые работают на принципе чрезвычайных оптической передачи. Биосенсор недорогой, надежный, легкий в использовании и может обнаружить сердца тропонина I в сыворотке в клинически значимых концентрациях (99й процентили среза ∼10-400 пг/мл, в зависимости от анализа).
Общая цель этого метода заключается в измерении биомаркеров, присутствующих в сложном фоне биологической жидкости, в клинически значимых концентрациях в медицинских учреждениях без необходимости сложных оптических или электрических настроек. Этот метод может помочь в реализации биосенсоров, основанных на экстраординарной передаче, в сценариях оказания медицинской помощи. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует сложных электрических или оптических настроек.
В наших экспериментах он смог надежно обнаруживать биомаркеры в клинически значимых концентрациях. Изготовление сенсорного чипа производится в чистом помещении и не может быть заснято на пленку. В демонстрационных целях процедура представлена здесь в виде анимации.
Для приготовления никелевой формы нанесите слой отрицательного электронного резиста толщиной 220 нанометров на четырехдюймовую кремниевую пластину толщиной 600 микрон. Запишите на эту пластину спроектированную матрицу нанодырок с помощью системы электронно-лучевой литографии. Чтобы ускорить запись электронным лучом, запишите шаблоны с низкой точечной картой 20 000 для каждого размера поля размером 300 микрон.
Проявите резист, погрузив четырехдюймовую кремниевую пластину в раствор проявителя на 10 секунд и дав ей высохнуть на воздухе. Нанесите на кремниевую пластину затравочный слой металла, например никеля, меди или алюминия. Затем гальваническое покрытие пластины в системе гальванического покрытия в ванне с сульфатом никеля в два этапа.
Отделите никелевую форму от силиконовой подложки, приложив мягкое механическое усилие. Затем, используя наноимпринтер, отпечатайте наноузоры на четырехдюймовой стеклянной пластине, которая позже была покрыта фотоотверждаемым резистом наноимпринтинга толщиной 300 нанометров. Перенесите форму, фоторезист и стеклянную пластину в систему УФ-отверждения и фотоотверждения.
Если все шаги были соблюдены правильно, никелевая форма должна быть легко извлечена из фоторезиста. После выполнения вытравливания заготовки фоторезиста на стеклянной подпрямой, на стеклянной пластине, в электронно-лучевой машине наносится слой хрома для сцепления металла и слой золота для плазмонного сенсора. Выполните отрыв фоторезиста с помощью кислородного плазменного травления в течение трех минут, после чего следует 15-секундный этап зонофизации в ацетоне.
Затем нарежьте образец кубиками размером пять на пять миллиметров. Массив наноотверстий будет занимать центральный, два на два миллиметра квадратный квадрат чипа. Чтобы получить данные, настройте аппарат для выполнения оптических измерений таким образом, чтобы луч белого света, выходящий через конец оптического волокна передатчика, попадал в колонку и падал на поверхность датчика под углом 90 градусов.
Свет проходит через всю массив наноотверстий. Собирайте передаваемый сигнал с помощью оптического волокна приемника и записывайте его с помощью спектрометра UV-видимого диапазона, работающего в диапазоне от 300 до 1000 нанометров. Для испытания на объемную чувствительность датчика нанесите стандартную жидкость с показателем преломления в жидкую ячейку с показателями преломления от 1,31 до 1,39.
Погрузите чип датчика в жидкость со стандартным показателем преломления и выровняйте его по лучу белого света. Затем получите спектр пропускания. Очищайте чип датчика после каждого измерения поверхностно-активным чистящим реагентом и вытирайте его насухо газообразным азотом.
Для модификации поверхности датчика очистите чипы датчика путем последовательного погружения в изопропанол, ацетон и деионизированную воду перед любыми химическими модификациями. Затем высушите микросхемы датчика комнатной температуры в паре из сухого газообразного азота. Далее инкубируйте чипы датчика в этаноловом растворе в течение 12 часов при комнатной температуре.
При этом образуется аминоспособный, самоорганизующийся монослой. После инкубации используйте этанол для тщательной промывки и сушки чипсов при комнатной температуре. Далее погрузите чипсы в смесь 75 миллимолярного сульфо-н-гидроксисукцинимида и 15-миллимолярного EDC на 15 минут.
Это активирует карбоксилевую группу самособирающегося монослоя. Затем нанесите на поверхность датчика 50 микролитров раствора антитрипонентного антитела с концентрацией 200 микрограмм на миллилитр, изготовленного в буфере из ацетата Ph 4,5. После инкубации в течение 30 минут деактивируйте нереактивные эфиры, погрузив сенсорный чип в один молярный раствор этаноламина гидрохлорида на 15 минут.
Наконец, промойте чип деионизированной водой и высушите его в потоке сухого газообразного азота при комнатной температуре. Заблокируйте любое неспецифическое связывание, нанеся 100 микролитров 1% раствора бычьего сывороточного альбумина на поверхность сенсорного чипа. Выдерживать в течение 15 минут.
Трижды промойте чипы датчика в фосфатно-солевом буферном растворе. Вставьте чип в измерительную ячейку, чтобы записать спектр пропускания. Это и есть опорный спектр.
Затем нанесите на поверхность чипа 50 микролитров сердечного тропонина. Выдержите чип во влажной среде в течение 30 минут. После трехкратной промывки чипов датчика в растворе PBS, вставьте его в измерительную ячейку для записи спектра пропускания.
Это спектр после связывания. Затем погрузите чипы в 50 миллимолярный глицин HCL на одну минуту, а затем трижды промойте в растворе PBS для регенерации поверхности чипа. Измерьте спектр пропускания в PBS, чтобы убедиться в успешности этапа регенерации.
Показано изменение спектра пропускания биосенсора при взаимодействии с 30 нанограммами на миллилитр сердечного тропонина человека в сыворотке крови. Синий график представляет до взаимодействия, а красный — после взаимодействия. Пунктирный круг указывает на отслеживаемый диапазон.
Здесь показан сдвиг длины волны для второго канала при концентрациях тропонина 2,5 нанограмма на миллилитр, 7,5 нанограмма на миллилитр, 30 нанограммов на миллилитр и 75 нанограммов на миллилитр. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. На этом графике показан сдвиг длин волн полос, наблюдаемый после регенерации для биосенсорного чипа с нанодырками.
Смещение положения второй полосы обратно в исходное положение указывает на то, что этап регенерации был успешным. После освоения измерения можно выполнить за один час при правильном выполнении. При измерении биоаналитов в этом методе важно использовать свежеприготовленные реактивы.
Пожалуйста, убедитесь, что вы вынули расходные материалы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготавливать биосенсоры, работающие по принципу экстраординарной оптической передачи и способные контролировать биоаналиты на сложном фоне. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что трудно создать высокоточные массивы наноотверстий, которые позволяют сопрягать чип с оптическим волокном без необходимости использования микроскопа и выбора воспроизводимых смол.
Этот метод позволяет проводить серийные измерения, которые имеют решающее значение в медицинских учреждениях. Изготовление чипа имеет большое значение для обеспечения воспроизводимости измерений. Поскольку базовая платформа остается прежней, дальнейшие усовершенствования этого метода будут происходить за счет использования метода с лучшим разрешением, который улучшит чувствительность, и от использования методов обработки сигнала для достижения лучшего соотношения сигнал/шум.
Применение этого метода распространяется на мониторинг множественных биоаналитов на сложном фоне сыворотки в условиях оказания медицинской помощи в режиме реального времени.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе описывается метод нанопечатной литографии для изготовления высококачественных сенсорных массивов, работающих по принципу необычного оптического пропускания. Биосенсор разработан для применения в точках оказания медицинской помощи, что позволяет обнаруживать сердечный тропонин I в сыворотке крови в клинически значимых концентрациях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биотехнология
- Биомедицинская инженерия
Теоретические основы
- Необходимость надежного обнаружения биомаркеров в сложных биологических жидкостях.
- Проблемы, связанные с традиционными технологиями биосенсоров.
- Принцип необычного оптического пропускания в биосенсорике.
- Важность диагностики по месту оказания медицинской помощи в клинических условиях.
Цель исследования
- Разработка недорогого и надежного биосенсора для определения сердечного тропонина I.
- Упрощение процесса детекции за счет отказа от сложных лабораторных установок.
- Демонстрация возможности применения биосенсоров на основе эффекта экстраординарной transmissions в клинической практике.
Используемые методы
- Нанопечатная литография для изготовления сенсора.
- Тестирование биосенсора в образцах сыворотки.
- Анимационное представление процесса изготовления.
- Оценка пределов обнаружения и показателей эффективности.
Основные результаты
- Биосенсор способен определять сердечный тропонин I в диапазоне концентраций от 10 до 400 pg/mL.
- Он эффективно работает в условиях диагностики по месту оказания медицинской помощи (point-of-care).
- Продемонстрирована надежность обнаружения биомаркеров в сложных биологических жидкостях.
- Устраняет необходимость в использовании сложных оптических или электрических установок.
Выводы
- Данный метод представляет собой значительный прогресс в технологии биосенсоров.
- Он обладает потенциалом для улучшения экспресс-диагностики сердечно-сосудистых заболеваний.
- Будущие исследования могут быть сосредоточены на расширении спектра определяемых биомаркеров.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данная биосенсорная платформа отвечает критической потребности в надежном и недорогом определении кардиологических биомаркеров в сложных биологических жидкостях, таких как сыворотка крови человека, что напрямую способствует оптимизации рабочих процессов диагностики по месту оказания медицинской помощи. Обеспечивая воспроизводимые количественные измерения сердечного тропонина I в клинически значимых концентрациях без использования сложных оптических или электрических установок, данный метод снижает технические барьеры для ранней диагностики и стратификации рисков при сердечно-сосудистых заболеваниях. Высокоточное изготовление методом наноимпринтинга обеспечивает минимальную вариативность между чипами, что способствует масштабируемому производству и стабильной эффективности анализа на этапах фундаментальных и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет изучать динамику высвобождения сердечного тропонина как механистического биомаркера повреждения миокарда в доклинических моделях.
- Практическая ценность: обеспечивает безметковый оптический метод считывания, совместимый с высокоточными массивами наноотверстий для стабильного детектирования сигнала в сыворотке крови.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественные данные о сдвиге длины волны, которые коррелируют с концентрацией аналита, что позволяет определять зависимость «доза-эффект» в сывороточных матрицах.
- Практическая ценность: поддерживает стратегию «один чип — одно измерение» с низкой вариабельностью, что повышает воспроизводимость для стандартизации анализа и скрининга реагентов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает мониторинг кинетики сердечных биомаркеров в сыворотке крови человека при соответствующих заболеваниях, улучшая трансляционную преемственность от этапа открытия до валидации.
- Практическая ценность: устраняет необходимость в использовании микроскопии благодаря большим областям детектирования (1,5 mm x 1,5 mm), упрощая интеграцию со стандартными лабораторными источниками света и спектрометрами.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум от раннего поиска до идентификации лидерных соединений, обеспечивая надежный количественный анализ для детекции биомаркеров в сложных жидкостях, что позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки на основании данных о взаимодействии с мишенью и модуляции сигнального пути.
- Биология открытий: позволяет проверять гипотезы о механизмах повреждения сердца посредством надежного обнаружения тропонина I в физиологически значимых концентрациях в сыворотке крови.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые сдвиги спектра пропускания, что позволяет сравнивать уровни биомаркеров при различных экспериментальных условиях без использования сложного оборудования.
- Аналитика: предоставляет измерения сдвига длины волны (например, полосы два) в качестве количественного выходного показателя для отслеживания связывания биомаркеров и эффективности регенерации.
- Трансляционные исследования: используют сыворотку крови человека в качестве матрицы детекции, что обеспечивает актуальность для клинических образцов и снижает риск межвидовых различий при трансляции результатов.
- Промышленное применение: процесс изготовления на основе наноимпринтинга может быть использован для нескольких поколений чипов, что поддерживает масштабируемость платформы для создания мультиплексных панелей биомаркеров.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность обнаружения биомаркеров благодаря клинически значимому пределу обнаружения (LOD 0.55 ng/mL) и минимальной вариабельности между чипами.
- Операционная ценность: Стандартизация с помощью наноимпринтной литографии и совместимость с распространенными УФ-видимыми спектрометрами и установками на базе оптоволокна.
- Стратегическая ценность: Снижение биологических рисков на поздних стадиях за счет обеспечения раннего и точного мониторинга биомаркеров в условиях, имитирующих диагностику по месту оказания помощи (POC).
- Влияние на портфель: Поддержка приоритизации кандидатов, нацеленных на сердечно-сосудистую систему, с учетом рисков благодаря надежным показателям, совместимым с сывороткой крови.
Особенности реализации
- Требуются знания в области нанопечатной литографии, химии поверхности и оптической спектроскопии для изготовления и функционализации чипов.
- Зависимость от доступа к чистому помещению для создания мастер-формы и систем УФ-отверждения для полимеризации резиста.
- Необходима стандартизированная подготовка поверхности (например, блокировка BSA, промывка EDTA) для минимизации неспецифического связывания в сывороточных матрицах.
- Адаптация к другим биомаркерам требует подтверждения эффективности иммобилизации антител и стабильности регенерации в сложных жидкостях.
- Практическое ограничение: эффективность регенерации должна проверяться в каждом цикле для обеспечения воспроизводимости поверхности при серийных измерениях.
