Флуорометрия с фиксацией напряжения в Xenopus Ооциты с использованием флуоресцентных неестественных аминокислот

В этой статье описывается усовершенствование традиционной флюорометрии с напряжением (VCF), в которой вместо малеимидных красителей используются флуоресцентные неестественные аминокислоты (fUAA), чтобы исследовать структурные перестройки в ионных каналах. Процедура включает в себя инъекцию ДНК ооцита Xenopus, совместную инъекцию РНК / fUAA и одновременные измерения тока и флуоресценции.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы ввести флуоресцентную неестественную аминокислоту в мембранный белок, экспрессируемый в ооцитах Xenopus, и одновременно определить функцию белка и структурную перестройку с помощью флуориметрии с вольт-клэмпингом. Данная методика поможет ответить на ключевые вопросы в области структурно-функциональных отношений мембранных белков. Используя флуориметрию с потенциальными зажимами, мы можем напрямую соотнести структурные перестройки с функцией белка.

Добавление к нему флуоресцентных неестественных аминокислот помогает преодолеть прежние ограничения на мечение. Когда-то это было связано с доступностью сайтов мечения, а также с фоновой мечением из-за эндогенных сайтов связывания. Применение этого метода распространяется на лучшее биофизическое понимание мембранных белков, потому что теперь вы можете исследовать домены, которые ранее были недоступны с помощью традиционной флуориметрии с напряжением.

После хирургического удаления ооцитов Xenopus трижды промойте ооциты раствором SOS. Отбирайте крупные и здоровые ооциты по отдельности и инкубируйте их при температуре 18 градусов Цельсия в течение не менее четырех часов в растворе Барта с добавлением антибиотиков и 5% лошадиной сыворотки перед инъекцией. Для ядерной инъекции ДНК подготовьте длинный и тонкий наконечник для инъекции, чтобы он достиг ядра без повреждения ооцитов.

Затем заполните наконечник для впрыска маслом и установите наконечник для впрыска на устройство наноинжектора. Далее установите наноинъектор под стереомикроскоп и сломайте конец наконечника щипцами. После этого выдавливайте масло до тех пор, пока внутри конца наконечника не останется пузырьков воздуха.

После этого поместите один микролитр 0,1 микрограмма на микролитр pAnap в безнуклеазную воду на кусок парапленки под стереоскопом и заполните наконечник для инъекции ДНК. Затем перенесите ооциты в сетчатую инъекционную чашку, содержащую раствор Барта, дополненный антибиотиками. Поскольку ядро ооцита расположено в полюсе животного, направьте наконечник для инъекции в центр полюса животного и пронзите его так, чтобы кончик достигал почти центра полусферы животного.

Далее введите 9,2 нанолитра раствора pAnap в ядро каждой ооциты. Затем инкубируйте ооциты в двух миллилитрах раствора Барта с добавлением антибиотиков и 5% лошадиной сыворотки при температуре 18 градусов Цельсия в течение 6-24 часов, чтобы обеспечить устойчивую экспрессию Anap-специфичных тРНК и тРНК-синтетаз. Теперь снова приготовьте наноинъектор, но на этот раз наконечник для инъекции не обязательно должен быть таким же тонким, как для инъекции ДНК.

С этого момента работайте только при красном свете, чтобы предотвратить фотообесцвечивание анапа. Смешайте один микролитр одномиллимолярного анапа с одним микролитром одного-двух микрограммов на микролитр мРНК непосредственно на куске парапленки и заполните наконечник для инъекции раствором смеси. Пронзите кончик в вегетативном полюсе чуть ниже мембраны и введите 46 нанолитров раствора смеси в каждый введенный pAnap ооцит.

Затем защитите ооциты от света, поместив их в светонепроницаемую коробку или обернув колбу алюминиевой фольгой. Инкубируйте их в растворе Барта с добавлением антибиотиков и 5% лошадиной сыворотки при 18 градусах Цельсия в течение двух-трех дней. Заменяйте его свежим раствором Барта каждый день и удаляйте мертвые ооциты, чтобы избежать заражения.

В этой конфигурации оборудование для размыкания напряжения интегрировано в установку флуоресцентной микроскопии. Записывающая камера установлена на слайдере, что позволяет ей перемещаться между стандартным стереоскопом для размещения ооцита и микроскопом для выполнения флуоресцентных измерений. Система детектирования фотодиодов подключается к выходному порту C-mount флуоресцентного микроскопа, а счетчик фототока подключается ко второму входному каналу в цифровом сигнальном процессоре.

В качестве источника света для возбуждения флуоресценции используется 100-ваттная 12-вольтовая галогенная лампа. Возбуждение контролируется механическим затвором между источником возбуждающего света и микроскопом. Активация запускается с помощью импульса TTL, поступающего от цифрового сигнального процессора, который синхронизируется в программном обеспечении записи таким образом, что затвор открывается примерно за 100 миллисекунд до начала записи, и в револьверной головке фильтрующего куба требуется соответствующий фильтрующий куб.

Для двухцветных ВЦФ подготовленные ооциты инкубируют в пятимикролярном малеимиде TMR в растворе для мечения в течение 15 минут непосредственно перед регистрацией. Затем трижды промойте ооциты раствором для мечения, чтобы удалить излишки красителя перед записью. На этом этапе белок специфически помечается двумя разными флуорофорами.

После установки ооцита, когда полюс животного направлен вверх и пропитан, сдвиньте камеру к микроскопу и сфокусируйтесь на ооците с помощью объектива 4X. Затем пронзите ооцит потенциал-чувствительным электродом V1. Затем переключитесь на цель 40-кратного погружения в воду.

Сосредоточьтесь на столбе животного, который обращен вверх. После этого выключите красный свет. Выберите фильтрующий куб Anap, повернув револьверную головку фильтра и оптический выходной порт, подключенный к фотодиоду.

После этого включите галогеновую лампу на максимальную интенсивность и откройте затвор на две-пять секунд, чтобы узнать интенсивность фоновой флуоресценции, исходящую от ооцита. После этого включите зажим, переведите переключатель ванны/ограждения в активное положение и отрегулируйте потенциал мембраны до командного потенциала, повернув ручку на сцене. Затем выберите потенциал удержания, протокол шага, количество и длину импульсов в программном обеспечении для записи.

Затем запишите зависящие от напряжения токи и интенсивность флуоресценции Анапа. Для двухцветной VCF выберите куб фильтра TMR, повернув барабанную головку куба. Считывание фоновой флуоресценции для TMR, как описано для Anap, и одновременная запись токов, зависящих от напряжения, и интенсивности флуоресценции TMR.

На этом рисунке показаны флуоресцентные сигналы Anap и TMR с использованием шаговых протоколов, полученных из одного и того же ооцита, экспрессирующего мутант Шейкера. Добавив цистеин, доступный из внешнего раствора, в фон L382-стопа W434F и пометив его малеимидом TMR, можно одновременно исследовать движения в разных областях одного и того же белка в реальном времени. Зависимость напряжения флуоресценции получается путем построения графика зависимости интенсивности стационарной флуоресценции от напряжения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как экспрессировать флуоресцентные неестественные аминокислоты в ооциты Xenopus и как выполнять одноцветную или двухцветную флуориметрию с напряжением. Как только вы освоите технику, это должно занять примерно столько же времени, сколько и традиционные эксперименты по электрофизиологии, просто у вас будет дополнительный шаг — введение ДНК в ядро ооцита. При попытке выполнить эту процедуру важно не забыть проверить экспрессию утечек в отсутствие неестественной аминокислоты.

Это должно быть сделано для каждой мутации, так как величина экспрессии утечки зависит от места вставки стоп-кодона в белке. Этот метод позволяет исследователям изучать конформационные изменения на цитозольном участке белка, где происходят многие регуляторные механизмы.