Флуорометрия с фиксацией напряжения в

Общая цель данной процедуры заключается в введении флуоресцентной ненатуральной аминокислоты в мембранный белок, экспрессируемый в ооцитах Xenopus, и одновременном определении функции белка и его структурной перестройки с помощью вольтамперометрической флуориметрии. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области взаимосвязи структуры и функции мембранных белков. Используя вольтамперометрическую флуориметрию, мы можем напрямую соотнести структурные перестройки с функцией белка.

Добавление флуоресцентной маркировки неестественными аминокислотами помогло преодолеть прежние ограничения процесса мечения. Ранее ими были доступность сайтов маркировки, а также фоновое мечение из-за эндогенных сайтов связывания. Применение этого метода способствует более глубокому биофизическому пониманию мембранных белков, поскольку теперь можно исследовать домены, которые ранее были недоступны при использовании традиционной флуорометрии с фиксацией потенциала.

После хирургического извлечения ооцитов Xenopus трижды промойте их раствором SOS. Индивидуально отберите крупные и здоровые ооциты и перед инъекцией инкубируйте их при 18 °C в течение не менее четырех часов в растворе Барта с добавлением антибиотиков и 5% сыворотки лошади. Для ядерной инъекции ДНК подготовьте длинный и тонкий наконечник для инъекций, чтобы достичь ядра, не повредив ооциты.

Затем заполните кончик иглы маслом и установите его в устройство наноинъектора. Далее установите наноинъектор под стереомикроскопом и с помощью пинцета сколите кончик иглы. После этого выдавливайте масло до тех пор, пока в конце иглы не исчезнут пузырьки воздуха.

После этого нанесите 1 µL pAnap в концентрации 0,1 µg/µL в воде без нуклеаз на кусочек Parafilm под стереомикроскопом и заполните кончик иглы для инъекций ДНК. Затем перенесите ооциты в чашку для инъекций с сеткой, содержащую раствор Барта с добавлением антибиотиков. Поскольку ядро ооцита расположено в анимальном полюсе, направьте кончик иглы в центр анимального полюса и проведите прокол так, чтобы кончик достиг области центра анимального полушария.

Затем введите 9,2 нанолитров раствора pAnap в ядро каждого ооцита. После этого инкубируйте ооциты в двух миллилитрах раствора Барта с добавлением антибиотиков и 5% сыворотки лошади при 18 °C в течение от 6 до 24 часов для обеспечения стабильной экспрессии Anap-специфических тРНК и тРНК-синтетаз. Теперь снова подготовьте наноинъектор, но на этот раз кончик иглы не должен быть таким тонким, как для инъекции ДНК.

С этого момента работайте только при красном свете, чтобы предотвратить фотообесцвечивание Anap. Смешайте 1 µL 1 mM Anap с 1 µL мРНК в концентрации от 1 до 2 µg/µL непосредственно на кусочке Parafilm, и заполните кончик инъекционной иглы полученным раствором. Введите иглу в вегетативный полюс чуть ниже мембраны и введите 46 nL раствора смеси в каждый ооцит, в который вводится pAnap.

Затем защитите ооциты от света, поместив их в светонепроницаемый контейнер или обернув колбу алюминиевой фольгой. Инкубируйте их в растворе Барта с добавлением антибиотиков и 5% сыворотки лошади при 18 °C в течение двух-трех дней. Ежедневно заменяйте раствор на свежий раствор Барта и удаляйте погибшие ооциты во избежание контаминации.

В данной установке оборудование для фиксации потенциала с разрезом интегрировано в систему флуоресцентной микроскопии. Регистрирующая камера установлена на слайдере, который позволяет перемещать её между стандартным стереомикроскопом, используемым для размещения ооцита, и микроскопом для проведения флуоресцентных измерений. Система детектирования на основе фотодиода подключена к выходному порту C-mount флуоресцентного микроскопа, а считывание фототока подключено ко второму входному каналу цифрового сигнального процессора.

В качестве источника света для возбуждения флуоресценции используется 100-ваттная галогенная лампа с напряжением 12 вольт. Возбуждение контролируется механическим затвором, расположенным между источником возбуждающего света и микроскопом. Активация срабатывает посредством TTL-импульса от цифрового сигнального процессора, синхронизированного в программном обеспечении для записи таким образом, чтобы затвор открывался примерно за 100 миллисекунд до начала записи; при этом в револьвере фильтров должен быть установлен соответствующий фильтр-куб.

Для двухцветного VCF непосредственно перед записью инкубируйте подготовленные ооциты в 5 µM TMR малеимида в маркировочном растворе в течение 15 минут. Затем трижды промойте ооциты маркировочным раствором, чтобы удалить избыток красителя перед началом записи. На данном этапе белок специфически маркирован двумя различными флуорофорами.

После закрепления ооцита пермеабилизированным животным полюсом вверх, переместите кювету под микроскоп и сфокусируйтесь на ооците с помощью объектива 4X. Затем проколите ооцит электродом V1, чувствительным к напряжению. После этого переключитесь на объектив с водным погружением 40X.

Сфокусируйтесь на животном полюсе, который обращен вверх. После этого выключите красный свет. Выберите куб фильтра Anap, повернув турель кубов фильтров, и выберите выходной оптический порт, подключенный к фотодиоду.

После этого включите галогеновую лампу на максимальную интенсивность и откройте затвор на два-пять секунд, чтобы измерить интенсивность фоновой флуоресценции ооцита. Затем включите зажим, переведите переключатель ванны/защитного экрана в активное состояние и с помощью ручки на головном блоке доведите мембранный потенциал до заданного потенциала. После этого в программном обеспечении для регистрации выберите удерживающий потенциал, протокол ступеней, количество и длительность импульсов.

Затем зарегистрируйте вольт-зависимые токи и интенсивность флуоресценции Anap. Для двухцветного VCF выберите фильтр-куб TMR, повернув турель кубов. Измерьте фоновую флуоресценцию для TMR, как описано для Anap, и одновременно зарегистрируйте вольт-зависимые токи и интенсивность флуоресценции TMR.

На этом рисунке представлены сигналы флуоресценции Anap и TMR, полученные с помощью ступенчатых протоколов из одного и того же ооцита, экспрессирующего мутант Shaker. Путем введения остатка цистеина, доступного из внешнего раствора, в фон L382 stop W434F и его мечения TMR-малеимидом становится возможным одновременное исследование перемещений в различных областях одного и того же белка в режиме реального времени. Зависимость флуоресценции от напряжения получена путем построения графика интенсивности флуоресценции в стационарном состоянии в зависимости от напряжения.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как экспрессировать флуоресцентные неестественные аминокислоты в ооцитах Xenopus и как проводить одно- или двухцветную флуорометрию с фиксацией потенциала. После освоения данной методики она будет занимать примерно столько же времени, сколько и традиционные электрофизиологические эксперименты, с одним дополнительным этапом — инъекцией ДНК в ядро ооцита. При выполнении этой процедуры важно не забывать проверять наличие фоновой экспрессии в отсутствие неестественной аминокислоты.

Это необходимо выполнить для каждой мутации, так как уровень остаточной экспрессии зависит от сайта вставки стоп-кодона в белке. Теперь данный метод позволяет исследователям изучать конформационные изменения на цитозольной стороне белка, где происходит большинство регуляторных механизмов.