Новый метод моделирования хронической травматической энцефалопатии в Drosophila

Общая цель этой новой процедуры состоит в том, чтобы нанести закрытые черепно-мозговые травмы плодовой муше дрозофиле, чтобы создать новую модель хронической травматической энцефалопатии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хронической травматической энцефалопатии, например, как повторяющаяся травма вызывает дегенерацию нейронов. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она доставляет повторяющиеся удары регулируемой силы непосредственно на голову мухи, не причиняя вреда другим частям тела животного.

Демонстрация этого метода в реальных условиях имеет решающее значение, так как этапы сборки устройства и погрузки на муху сложны в освоении, потому что голова дрозофилы очень мала и важно наносить удар только на голову. Чтобы изготовить устройство, используемое для сотрясения мозга или удара по плодовым мушам, сначала сделайте ударную часть устройства. Извлеките поршень из поликарбонатного туберкулинового шприца объемом в один миллилитр, а затем разрежьте цилиндр на отметке в один миллилитр.

В качестве ударного элемента используйте аэрозольный барьер, который находится на наконечнике пипетки объемом 200 микролитров. Этот ударный элемент должен быть три миллиметра в длину и четыре миллиметра в диаметре. Затем упакуйте ударный элемент в цилиндр шприца плоской стороной к соплу.

Чтобы обеспечить усилие, прикрепите цилиндр шприца к регулятору расхода углекислого газа. Регулятор должен иметь тумблер On Off и хорошо контролировать расход газа. Затем прижмите ствол вертикально к железной подставке так, чтобы ударный элемент упал на дно бочки.

Далее сделайте держатель для мух. Начните с наконечника для пипетки объемом 200 микролитров. Отрежьте кончик пипетки в пяти миллиметрах от малого конца, чтобы получилось отверстие диаметром 8 миллиметров.

Голова мухи пролезет через это отверстие, а грудная клетка - нет. Наконец, сделайте держатель для мухи и ударное устройство. Сначала отрежьте кончик пипетки объемом в один миллилитр в 44 миллиметрах от маленького отверстия.

Во-вторых, отрезаем шестимиллиметровую длину от игольчатой крышки для одномиллилитрового шприца. Затем сдвиньте их вместе. Обезболите одну двухдневную взрослую самку мухи углекислым газом.

С помощью губки с углекислым газом аккуратно перенесите муху в держатель. Затем аккуратно постучите по держателю, пока головка не выступит из кончика. Если хоботок обнажен, используйте затупленную иглу шприца объемом в один миллилитр, чтобы аккуратно заправить его обратно внутрь кончика.

Очень важно, чтобы тело мухи, особенно ротовая часть, находилось внутри держателя. В противном случае муха может погибнуть от повреждения внутренних органов или от невозможности проглотить пищу. Далее установите давление газа на 100 кПа и при необходимости отрегулируйте расход.

Как только мушка будет заряжена, затяните держатель на цилиндре шприца с помощью разъема таким образом, чтобы головка мушки была направлена вниз. Затем с помощью тумблера подайте выброс газа, который приведет в движение ударный элемент, чтобы ударить муху один и только один раз. Теперь отсоедините держатель для мух и сбросьте муху обратно на подушечку с углекислым газом.

Смахните муху в пустой флакон, пока она не восстановится. Держите одну муху во флаконе. Восстановление занимает всего несколько минут.

Повторите процесс, чтобы испытать четыре мухи на одну экспериментальную группу. Обработка двух групп, теста и фикции, должна занять всего от 20 до 30 минут. Обращайтесь с имитацией так же, как с подопытными животными, за исключением того, что не включайте аэрозольный барьер в ударную трубку.

Чтобы отслеживать движения мухи в чашке Петри, сначала заполните шестисантиметровую чашку прозрачным силиконовым эластомером, чтобы сделать арену для слежения. Оставьте трехмиллиметровый зазор между силиконом и крышкой, чтобы мухи могли свободно ходить в зазоре, но не взлетать. Под ареной слежения располагайте белый фон.

Далее обезболите четырех мух из той же группы лечения и поместите их в арену. Дайте мухам акклиматизироваться в течение часа к арене, которая должна быть полностью освещена и при температуре около 22 градусов по Цельсию. Не горячее комнатной температуры.

Через час используйте камеру с зарядным устройством, расположенную над ареной, чтобы записывать активность мухи в течение пяти минут. После пятиминутной записи обезболите мух на арене и верните их в новый домашний флакон. Затем утилизируйте арену.

Позже проанализируйте записи с помощью бесплатного программного обеспечения Ctrax. Это программное обеспечение генерирует данные отслеживания, которые могут быть экспортированы в программируемый формат, совместимый с языком, например, формат MATLAB. На основе этих данных вычислите расстояние, пройденное за кадр, среднее расстояние ходьбы для каждой мухи и среднее расстояние, пройденное за одну муху.

Для статистической значимости следует ожидать тестирования около 100 мух в каждой группе лечения. Для установления модели хронической травматической энцефалопатии была проанализирована эффективность одной закрытой черепно-мозговой травмы, нанесенной ударным аппаратом на разных скоростях, с использованием двухдневных самок Canton-S. Давление газа держалось на уровне 100 кПа Па.

Мухи, подвергшиеся одиночному удару при самой высокой испытанной скорости потока, демонстрировали минимальные внешние дефекты. Несмотря на отсутствие явных доказательств внешних повреждений, травмы при расходе 15 литров в минуту были смертельными, что привело к выживаемости менее 10% в течение 24 часов. Выживаемость увеличивалась при более низких скоростях потока.

Стопроцентная выживаемость была достигнута при пяти литре в минуту и меньше, поэтому в качестве стандарта для модели было выбрано пять литров в минуту. Сразу после удара мухи постепенно восстанавливали свою подвижность в течение четырех минут. Восстановление после фиктивных операций происходило примерно на минуту быстрее.

Для измерения функции локомотива использовалось отслеживание движения после удара с помощью видео. В течение двух дней после удара передвижение медленно возвращалось в норму. Эти доказательства постепенного восстановления согласуются с восстановлением ХТЭ у людей.

Для оценки долгосрочных эффектов был применен повторяющийся протокол черепно-мозговой травмы, состоящий из пяти ударов в течение пяти дней. Через двадцать дней после лечения сравнивали передвижение выживших членов в каждой группе, и группа, получавшая лечение, явно меньше ходила. Продолжительность жизни в группе лечения также была значительно сокращена, с медианой в 26 дней по сравнению с 37 днями в контрольной группе.

После своего развития этот метод открывает путь исследователям в области легких повторяющихся черепно-мозговых травм для изучения патогенных механизмов в классической животной модели Drosophila melanogaster. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости защитить хоботок, грудную клетку и брюшную полость от прямого воздействия аэрозольного барьера.