Протокол отслеживания видеосигнала для фильтров сдерживающих устройств для медоносных пчел
12 июня 2017 г.
Потеря колоний медоносных пчел представляет собой проблему для услуг по обследованию культур. Современные методы защиты опылителей требуют альтернативного подхода к минимизации контакта медоносных пчел с вредными пестицидами с использованием репеллентных химикатов. Здесь мы предлагаем подробные методы для визуального протокола отслеживания экранов для пчел.
Общая цель данной процедуры — оценка химических репеллентов для медоносных пчел. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области энтомологии, например, какие химические вещества заставляют медоносных пчел избегать источника пищи. Основным преимуществом данного протокола является простой подход к скринингу химических репеллентов для медоносных пчел, позволяющий провести исследование относительно быстро и легко.
Для приготовления кубика из сахарно-агарозного геля для контрольной группы налейте полуохлажденный раствор сахарно-агарозного геля в форму из лодочки для взвешивания. Для группы с репеллентом добавьте необходимое количество соединения в полуохлажденный раствор агарозы. В данной демонстрации используется конечная концентрация 1% DEET.
Встряхните колбу круговыми движениями, чтобы перемешать соединение, затем перелейте раствор в формы для навески. После охлаждения кубиков из сахар-агарозного геля извлеките затвердевшие кубики из форм и поместите их в пластиковый контейнер с увлажненным бумажным полотенцем. Поместите контейнеры в холодильник для хранения.
В программном обеспечении для трекинга перейдите к настройкам эксперимента в панели обозреватора экспериментов, расположенной в левой части экрана. Убедитесь, что выбрана нужная камера и запись видео центрирована относительно арена-чашек Петри. Если запись видео требует центрирования, перейдите в настройки камеры, в раздел управления областью интереса, и выберите опции Center X и Center Y.
В настройках эксперимента (experiment settings) измените количество арен на 16. В разделе отслеживаемых признаков (tracked features) выберите определение центральной точки (center point detection). Затем перейдите в настройки арены (arena settings), чтобы настроить арену, необходимую для анализа.
Расположите 16 чашек Петри в виде квадрата 4×4 на лайтбоксе, установленном под камерой. В настройках арены используйте кнопку захвата фона (grab background), расположенную на правой панели инструментов, чтобы сделать снимок 16 чашек Петри. Это изображение будет использоваться в качестве шаблона для настройки арены.
Выберите инструмент «создать эллипс» на панели инструментов в верхней части экрана настроек арены и начертите круг, диаметр которого соответствует диаметру одной из чашек Петри на захваченном изображении. Поместите маркер арены один внутрь круга. Затем выберите группу зон один, расположенную под ареной один на панели инструментов в правой части экрана.
Выберите инструмент «Создать прямоугольник» на панели инструментов в верхней части экрана. С помощью этого инструмента создайте квадрат размером 30 на 30 пикселей. Затем расположите его в центре круга, созданного на предыдущем шаге.
Выберите «add zone» на верхней панели инструментов, затем щелкните в центре квадрата. Переместите зону на один маркер так, чтобы она оказалась внутри квадрата. Далее выберите «arena one» на панели инструментов справа и нажмите «duplicate complete arena».
В выпадающем меню выберите все остальные арены и нажмите ОК. Переместите продублированные настройки арен в остальные чашки Петри на захваченном изображении. Затем выберите арену один и нажмите «calibrate scale» (калибровка масштаба) на верхней панели инструментов. Проведите линию калибровки по диаметру чашки Петри арены один.
Измените измерение диаметра на nine centimeters. Выберите «validate arena settings» на панели инструментов справа. Затем выберите «detection settings» на панели управления слева.
Выберите параметры детектирования «один», затем в выпадающем меню в панели инструментов справа выберите градации серого. В разделе детектирования установите диапазон от 0 до 83. Щелкните правой кнопкой мыши по параметрам детектирования и создайте новую настройку под названием «Параметры детектирования два».
Убедитесь, что по-прежнему выбран режим оттенков серого (gray scaling), и не изменяйте остальные параметры. Выберите список испытаний (trial list) в окне исследования эксперимента (experimental explorer) и нажмите «добавить переменную» (add variable) на верхней панели инструментов. Назовите пользовательскую переменную Treatment.
Выберите выпадающий список «predefined values» в столбце «user defined treatment» и добавьте «control» и «treatment» в качестве предопределенных значений. Нажмите кнопку «add trials» на верхней панели инструментов и добавьте два повторности (испытания). Затем для каждой арены укажите, является ли она контрольной или экспериментальной.
Затем выберите «data profile» в панели «experiment explorer». В левом столбце выберите «treatment», расположенный в разделе «user defined independent variables». После этого в области со схемой появится поле фильтра.
Выберите C в раскрывающемся списке, а затем поместите только что созданный фильтр между блоком «start» и блоком «result one». Стрелки схемы должны перестроиться так, чтобы они указывали от блока «start» к фильтру и, наконец, к блоку «result one». Повторите этот шаг, но на этот раз выберите T для фильтра, а затем выберите «result» в разделе общих элементов.
Переместите недавно созданные блоки в область блок-схемы, соедините их стрелками и сохраните файл. Запустите программу визуального трекинга и откройте сохраненный экспериментальный файл, созданный для данного анализа. Выберите настройки детектирования «два».
Затем поместите контрольные кубики из сахарно-агарозного геля в центр восьми из 16 чашек Петри. Повторите эту процедуру с кубиками из сахарно-агарозного соединения в оставшихся восьми чашках. С помощью пинцета извлеките одну медоносную пчелу из пластикового контейнера и поместите ее в одну из контрольных чашек Петри.
Повторите этот шаг для остальных 15 чашек Петри. Поместите все чашки на световой стол. Подсветите световой стол снизу массивом светодиодов, настроенных на красный спектр, и расположите их таким образом, чтобы области обнаружения арены совпадали с аренами в каждой из чашек Петри.
Окружите весь бокс и камеру черным пластиковым листом, чтобы исключить попадание внешнего света и уменьшить количество теней внутри арен. После установки чашек Петри убедитесь, что выбрана настройка обнаружения «one». На данном этапе программное обеспечение для визуального трекинга должно фиксировать только медоносных пчел внутри арен в чашках Петри.
Затем выберите «acquisition» (сбор данных) в окне «experiment explorer». Нажмите зеленую кнопку «start trial» в появившемся окне управления сбором данных справа, чтобы начать запись. Выполняйте анализ в течение 10 минут, после чего нажмите красную кнопку «stop trial» в окне управления сбором данных, чтобы остановить запись.
Здесь представлены репрезентативные результаты влияния DEET на пищевое поведение отдельных медоносных пчел. Особи, подвергавшиеся воздействию контрольных кубиков, проводили в зоне кормления в среднем 343 секунды, по сравнению с 16 секундами для особей, подвергавшихся воздействию кубиков с DEET. Здесь показаны репрезентативные результаты влияния двух различных соединений на пищевое поведение отдельных медоносных пчел.
Особи, подвергшиеся воздействию нерепеллентного соединения, провели в зоне кормления в среднем 282 секунды, по сравнению с контрольной группой, которая провела там около 352 секунд. Воздействие репеллентного соединения приводит к тому, что особи проводят в зоне кормления значительно меньше времени — около 23 секунд, по сравнению с контрольной группой, которая провела в этой зоне в среднем 493 секунды.
При должном навыке эта процедура при правильном выполнении занимает 20 минут. При проведении данного метода важно помнить о необходимости предварительной подготовки всего оборудования и соблюдении достаточного периода голодания медоносных пчел. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как с помощью программного обеспечения для видеотрекинга определять воздействие соединения, введенного в пищевой источник, на отдельных особей медоносных пчел.
После выполнения данной процедуры можно провести другие методы анализа, такие как исследования в ближнем поле и полевые испытания, чтобы ответить на дополнительные вопросы о воздействии соединения на уровне колонии. После разработки эта методика позволила исследователям в области энтомологии изучать новые химические вещества и их влияние на пищевое поведение медоносных пчел. Не забывайте, что работа с химическими соединениями может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол оценки химических репеллентов для медоносных пчел (Apis mellifera L.) с использованием метода видеотрекинга. Этот метод позволяет проводить экспресс-скрининг соединений, которые могут отпугивать медоносных пчел от источников пищи, что является ценным инструментом для разработки стратегий по снижению воздействия пестицидов на опылителей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Энтомология
- Поведенческая экология
- Здоровье опылителей
Теоретические основы
- Медоносные пчелы являются важнейшими опылителями, имеющими большое экономическое и сельскохозяйственное значение.
- Численность колоний в США и Европе сокращается с 1947 года.
- Воздействие пестицидов является основным фактором, способствующим сокращению популяции медоносных пчел.
- Разработка репеллентов, отпугивающих пчел от обработанных культур, могла бы помочь снизить риски, связанные с воздействием пестицидов.
Цель исследования
- Разработать простой и эффективный протокол для скрининга химических репеллентов для медоносных пчел.
- Оценить поведенческую реакцию отдельных медоносных пчел на источники пищи, содержащие потенциальные репеллентные соединения.
- Создать основу для дальнейших исследований стратегий борьбы с вредителями, безопасных для опылителей.
Используемые методы
- Приготовление сахарно-агарозных кубиков с тестовыми соединениями (например, 1% DEET) и без них.
- Предварительное голодание пчел-фуражиров в течение ночи перед проведением теста.
- Помещение отдельных пчел в чашки Петри, содержащие либо контрольные, либо обработанные репеллентом кубики.
- Видеоотслеживание локомоторной активности пчел в световом боксе с использованием специализированного программного обеспечения.
- Анализ времени, проведенного пчелами в зоне кормления в течение 10-минутного периода анализа.
Основные результаты
- Пчелы, подвергшиеся воздействию контрольных кубиков, проводили значительно больше времени в зоне кормления (например, 343 секунды) по сравнению с пчелами, подвергшимися воздействию кубиков, обработанных ДЭТА (например, 16 секунд).
- Соединения, не обладающие репеллентными свойствами, не вызывали значительного сокращения времени кормления по сравнению с контролем.
- Репеллентные соединения приводили к заметному сокращению времени кормления (например, 23 секунды против 493 секунд в контроле).
- Данный протокол позволяет проводить быструю и воспроизводимую оценку химических репеллентов.
Выводы
- Данный метод представляет собой простой подход к скринингу потенциальных репеллентов для медоносных пчел.
- Он позволяет исследователям выявлять соединения, которые эффективно отпугивают пчел от источников пищи.
- Протокол способствует разработке методов борьбы с вредителями, безопасных для опылителей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Экспресс-скрининг репеллентных химических соединений у медоносных пчел с помощью видеотрекинга напрямую способствует валидации мишеней на ранних этапах разработки безопасных для опылителей агрохимикатов. Данный протокол позволяет проводить количественную оценку поведения, что снижает неопределенность в механизмах действия и помогает принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки соединений-кандидатов. Такой подход повышает прогностическую достоверность на стыке фундаментальной биологии и прикладного применения в рамках портфелей по экологической безопасности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить проверку гипотез о влиянии потенциальных репеллентных соединений на поведение опылителей.
- Обеспечивает биологическую оценку рисков путем количественного определения реакций избегания при воздействии конкретных химических веществ.
- Способствует функциональной валидации мишеней репеллентов перед проведением исследований в полевых условиях.
- Предоставляет воспроизводимую систему для механистической оценки рисков потенциальных агрохимических препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированный высокопроизводительный поведенческий анализ для скрининга соединений.
- Гарантирует воспроизводимость и количественное измерение времени пребывания в зонах кормления.
- Позволяет подготовить валидированные поведенческие конечные точки для последующих этапов оценки соединений.
- Обеспечивает возможность масштабируемого параллельного скрининга различных химических соединений в контролируемых условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит лабораторные показатели поведения в соответствие с трансляционной оценкой рисков для безопасности опылителей.
- Обеспечивает преемственность от скрининга in vitro до валидационных исследований в ближнем поле и в полевых условиях.
- Поддерживает риск-ориентированное внедрение химических репеллентов, имеющих экологическую значимость.
- Усиливает прогностическое снижение рисков с учетом регуляторных требований и принципов ответственного управления.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол видеотрекинга занимает определенное место в континууме от этапа открытия до доклинических исследований, связывая предварительный скрининг соединений с трансляционной оценкой рисков для безопасности опылителей.
- Фундаментальная биология: Количественная оценка поведенческого избегания как прямой показатель эффективности репеллента, что способствует проверке гипотез и уточнению путей взаимодействия.
- Скрининг: Обеспечение готовности и воспроизводимости анализа для быстрой оценки соединений-кандидатов.
- Аналитика: Получение количественных данных о времени пребывания в зоне, что позволяет проводить статистическое сравнение эффектов воздействия.
- Трансляционные исследования: Обеспечение преемственности с исследованиями в полевых условиях и на уровне колоний для комплексной оценки рисков.
- Корпоративное использование: Создание многократно используемой платформы для поведенческого скрининга в рамках текущих НИОКР в области агрохимии и экологической безопасности.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при выборе отпугивающих соединений.
- Операционная ценность: стандартизирует поведенческие тесты для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости при работе с библиотеками соединений.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределения капитала для портфелей химических веществ, безопасных для опылителей.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков и продвижение экологически ответственных кандидатов в агрохимикаты.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разработке поведенческих тестов и анализе данных видеотрекинга.
- Необходим доступ к откалиброванному оборудованию для видеотрекинга и помещениям с контролируемым освещением.
- Требуется межкомандная стандартизация настройки тестов и протоколов анализа данных.
- Может потребоваться адаптация для различных видов опылителей или классов соединений.
- Практические ограничения включают безопасность при работе с соединениями и экстраполяцию результатов на эффекты на уровне колонии.
