Точный подход к клеточной абляции для моделирования острой почечной недостаточности при развитии рыбок данио

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы индуцировать целевую абляцию клеток эпителия почек рыбок данио-рерио для моделирования повреждения и восстановления нефрона. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации органов и, в частности, почек. Например, какие основные клеточные процессы участвуют в регенерации, какова степень пластичности выживших тканей и многое другое.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет осуществлять точный пространственно-временной контроль травмы, а также возможность регулировать уровень травмы. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику острого повреждения почек, поскольку он позволяет точно оценить пространственные и временные процессы клеточных и молекулярных процессов, участвующих в повреждении и регенерации клеток почек. Для начала создайте эмбрионы путем скрещивания почек GFP флуоресцентных рыбок данио

В течение 24 часов после оплодотворения храните эмбрионы в растворе Е3 при температуре 28,5 градусов Цельсия. Затем используйте 0,003% PTU в E3, чтобы заменить среду E3. Верните эмбрионы в инкубатор на шесть или более дней, после чего почки созреют.

Чтобы составить карту рыбок данио-рерио для визуализации в реальном времени, приготовьте агарозу с низким таянием от 1% до 2% с 0,2 мг на миллилитр раствора тригейна. Убедитесь, что раствор агарозного тригейна остынет, прежде чем использовать пластиковую или стеклянную пипетку для переноса эмбриона в раствор. Далее с помощью переводной пипетки наберите личинку в агарозу и отложите ее в середину 35-миллиметровой посуды.

Быстро разложите агарозу, содержащую рыбок данио, чтобы равномерно покрыть дно блюда. Затем используйте стеклянный зонд для ориентации личинки для фотоабляции и визуализации таким образом, чтобы интересующий сегмент почки был перпендикулярен траектории луча, в то время как противоположный боковой сегмент находился вдали от лазерного луча. Ориентация рыбки данио имеет решающее значение для дальнейших этапов лазерной абляции.

Хорошей техникой советуют следить за тем, чтобы личинки сохраняли перпендикулярное положение в агарозе. Накройте чашку Петри, чтобы свести к минимуму испарение, и дайте агарозе застыть около 15 минут. После установки конфокального микроскопа, в соответствии с текстовым протоколом, в вертикальном положении, расположите чашку Петри, содержащую личинку, на предметном стекле микроскопа и удерживайте ее на месте с помощью пластилина.

Затем установите скользящую чашку Петри на предметный столик микроскопа. Затем добавьте три миллилитра раствора для визуализации. Под линзой, погружающейся в воду, медленно поднимайте предметный столик, следя за тем, чтобы линза была слегка наклонена, чтобы воздух не попал в луч

Как только хрусталик коснется раствора под углом, отцентрируйте его так, чтобы он оказался в поле зрения эмбриона. Теперь, используя флуоресцентный источник света, найдите интересующий сегмент, затем сосредоточьтесь на поверхностной ветви, чтобы нацелить ее на травму. Поверхностные ветви выбирают так, чтобы свести к минимуму рассеяние света.

В программном обеспечении микроскопа перейдите к просмотру, управлению сканированием, компактному графическому интерфейсу C2plus. Установите время пребывания в пикселях на 1,9 микросекунды, размер кадра на 512 на 512 пикселей и размер точечного отверстия на 90 микрон. Установите интенсивность лазера 405 нм равным нулю, а интенсивность лазера 488 — низким значением.

При использовании лазера с яркостью 488 нанометров нажмите кнопку сканирования в программном интерфейсе. Найдите интересующий сегмент, который перпендикулярен пути луча и хорошо визуализирован с хорошей флуоресценцией GFP. Как только этот регион будет определен, перейдите к ROI, нарисуйте эллиптический ROI, чтобы нарисовать интересующую область.

Затем перейдите к виду, элементам управления захватом, области сканирования C2plus и выберите область сканирования полосы, прямоугольная маска появится в этом интерфейсе. С помощью курсора вручную определите прямоугольное сканирование, чтобы покрыть сегмент, предназначенный для лазерной абляции. Щелкните правой кнопкой мыши в области маски, чтобы принять выделение.

Используя всего 488 нанометровый лазер для активации GFP, начните измерение времени с мониторинга зеленого канала. Убедитесь, что интенсивность лазера 488 относительно низкая. Измерьте среднюю интенсивность GFP в интересующей области, выбрав меру, измерение времени.

Используйте график или вкладку данных для мониторинга средних уровней интенсивности в пределах ROI. Используя фиолетовый лазер, вызывайте повреждение клеток почек, увеличивая интенсивность до 100%, сдвинув регулятор мощности лазера до упора вправо. На вкладке графика просмотрите линейный график или используйте вкладку данных для наблюдения за числовыми значениями интенсивности GFP и подождите, пока она не упадет до нужного уровня.

Например, 50% от базовой линии. Как только интенсивность GFP в пределах эллиптической ROI упадет до желаемого уровня, немедленно уменьшите интенсивность фиолетового лазера до нуля на программной панели управления, переместив ползунок мощности лазера до упора влево. Наконец, получить новую базовую линию флуоресценции GFP.

Как показано на этом рисунке, после воздействия лазерного света с яркостью 405 нанометров флуоресценция GFP продолжает исчезать по одной клетке за раз. До тех пор, пока на 220 минуте весь сегмент аблята не теряет 100% своего GFP-позитива. Это связано с гибелью клеток, а не с подавлением экспрессии GFP, о чем свидетельствует появление красных флуоресцентных ядер йодида пропидия в клетках, которые теряют GFP-положительность.

Эти изображения демонстрируют, что, варьируя первоначальное воздействие, можно определить травму и реакцию на поврежденный эпителий. При первоначальном фотообесцвечивании GFP от 10% до 20% практически не наблюдается снижения GFP-положительности через пять часов после травмы. 50% и 60% приводит к полному исчезновению GFP через пять часов, в то время как 30% и 40% обесцвечивание приводит к промежуточным результатам, при этом 50% предполагаемая смерть наблюдается при примерно 35% фотообесцвечивании.

Это поддерживается окрашиванием йодидом пропидия, при котором 20%-ное фотообесцвечивание приводит к практически полному отсутствию окрашивания йодидом пропидида через 100 минут после абляции. Тем не менее, 50%-ное фотообесцвечивание приводит к стойкому положительному результату йодида пропидия в абляционном эпителии через 60 минут. В то время как 30% и 40% фотообесцвечивание приводит к включению промежуточного йодида пропидия.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 30 минут, если она выполнена правильно. Не забывайте, что работа с лазерами и химическими реактивами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать такие меры предосторожности, как избегание взгляда на лазерный луч и использование перчаток при работе с химическими веществами. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как покадровая микроскопия, иммунофлуоресцентное окрашивание и другие, чтобы ответить на дополнительные вопросы, направленные на препарирование повреждения почек и восстановление на клеточном и молекулярном уровне.

После своего развития эта методика открыла путь для исследователей в области регенерации почек. Изучить роль коллективной миграции клеток и восстановления почек после травмы у рыбок данио. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать конфокальную микроскопию для повреждения определенных сегментов почек у личинок и эмбрионов трансгенных рыбок данио-рерио GPF.