Точный подход к клеточной абляции для моделирования острой почечной недостаточности при развитии рыбок данио

Общая цель данной процедуры заключается в индукции направленной абляции эпителиальных клеток почек Zebrafish для моделирования повреждения и восстановления нефронов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области регенерации органов и, в частности, почек, такие как: каковы основные клеточные процессы, участвующие в регенерации, какова степень пластичности выживших тканей и многие другие.

Основным преимуществом данного метода является возможность точного пространственно-временного контроля повреждения, а также возможность регулировать степень этого повреждения. Значимость данной методики распространяется на терапию или диагностику острого повреждения почек, поскольку она позволяет проводить точную пространственную и временную оценку клеточных и молекулярных процессов, участвующих в повреждении и регенерации клеток почек. Для начала получите эмбрионы путем скрещивания флуоресцентных Zebrafish с GFP-меткой в почках.

В течение 24 часов после оплодотворения держите эмбрионы в растворе E3 при 28.5 °C. Затем замените среду E3 на раствор 0.003% PTU в E3. Верните эмбрионы в инкубатор на шесть или более дней, после чего почки должны полностью созреть.

Для иммобилизации Zebrafish с целью прижизненной визуализации приготовьте 1%–2% раствор низкоплавящего агарозы с добавлением раствора тригаина в концентрации 0,2 мг/мл. Перед тем как перенести эмбрион в раствор с помощью пластиковой или стеклянной пипетки, убедитесь, что раствор агарозы с тригаином остыл. Затем, используя переносную пипетку, извлеките личинку вместе с агарозой и поместите её в центр чашки диаметром 35 мм.

Быстро распределите агарозу, содержащую Zebrafish, чтобы равномерно покрыть дно чашки. Затем с помощью стеклянного зонда ориентируйте личинку для фотоабляции и визуализации таким образом, чтобы интересующий сегмент почки находился перпендикулярно пути луча, а контралатеральный сегмент был отведен от лазерного луча. Правильное ориентирование Zebrafish имеет решающее значение для последующих этапов, включающих лазерную абляцию.

Для того чтобы личинка сохраняла перпендикулярное положение в агарозе, рекомендуется использовать специальный прием. Накройте чашку Петри для минимизации испарения и оставьте агарозу затвердевать примерно на 15 минут. После настройки конфокального микроскопа в вертикальной конфигурации согласно текстовому протоколу, поместите чашку Петри с личинкой на предметное стекло и зафиксируйте ее с помощью модельного пластилина.

Затем поместите скользящую чашку Петри на предметный столик микроскопа. После этого добавьте три миллилитра раствора для визуализации. Используя иммерсионный объектив для погружения в воду, медленно поднимайте столик, следя за тем, чтобы объектив был расположен под небольшим углом, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в путь луча.

Когда линза коснется раствора под углом, центрируйте ее так, чтобы эмбрион оказался в поле зрения. Теперь, используя источник флуоресцентного света, найдите интересующий сегмент, затем сфокусируйтесь на поверхностной ветви, чтобы нанести ей повреждение. Поверхностные ветви выбираются для минимизации рассеяния света.

В программном обеспечении микроскопа перейдите в меню view, acquisition control, C2plus compact GUI. Установите время выдержки пикселя (dwell time) на 1.9 microseconds, размер кадра — 512 by 512 pixels, а размер пинхола — 90 microns. Установите интенсивность лазера 405 nanometer на ноль, а интенсивность лазера 488 — на низкое значение.

При использовании лазера с длиной волны 488 нм нажмите «scan» (сканировать) в интерфейсе программного обеспечения. Найдите интересующий сегмент, который расположен перпендикулярно пути луча и хорошо визуализируется с выраженной флуоресценцией GFP. После идентификации этого участка перейдите в раздел ROI и выберите «draw elliptic ROI» (нарисовать эллиптическую область интереса), чтобы выделить область интереса.

Затем перейдите в меню View, Acquisition Controls, C2plus scan area и выберите Band scan area; в этом интерфейсе появится прямоугольная маска. С помощью курсора вручную задайте прямоугольную область сканирования, охватывающую сегмент, предназначенный для лазерной абляции. Щелкните правой кнопкой мыши внутри области маски, чтобы подтвердить выбор.

Используя только лазер с длиной волны 488 нм для активации GFP, начните измерение времени, контролируя зеленый канал. Убедитесь, что интенсивность лазера 488 нм относительно низкая. Измерьте среднюю интенсивность GFP в области интереса, выбрав «measure» (измерение), затем «time measurement» (измерение времени).

Используйте вкладку «График» или «Данные» для мониторинга среднего уровня интенсивности внутри ROI. С помощью фиолетового лазера вызовите повреждение клеток почки, увеличив интенсивность до 100%, переместив регулятор мощности лазера максимально вправо. На вкладке «График» наблюдайте за линейным графиком или используйте вкладку «Данные» для отслеживания числовых значений интенсивности GFP и дождитесь, пока она упадет до желаемого уровня.

Например, до 50% от базового уровня. Как только интенсивность GFP внутри эллиптического ROI упадет до желаемого уровня, немедленно снизьте интенсивность фиолетового лазера до нуля в панели управления программным обеспечением, переместив ползунок мощности лазера максимально влево. В завершение получите новый базовый уровень флуоресценции GFP.

Как показано на этом рисунке, после воздействия лазерного излучения с длиной волны 405 нм флуоресценция GFP продолжает исчезать последовательно, по одной клетке. К 220 минутам весь абляционный сегмент полностью теряет экспрессию GFP (100%). Это происходит вследствие гибели клеток, а не из-за снижения экспрессии GFP, о чем свидетельствует появление ядер, положительных по красному флуоресцентному пропидийиодиду, в клетках, утративших флуоресценцию GFP.

Эти изображения демонстрируют, что путем варьирования начальной экспозиции можно регулировать степень повреждения и ответ поврежденного эпителия. При начальном фотообесцвечивании GFP от 10% до 20% через пять часов после повреждения практически не наблюдается снижения положительной экспрессии GFP. Выжигание на 50% и 60% приводит к полному исчезновению GFP через пять часов, в то время как обесцвечивание на 30% и 40% дает промежуточные результаты, причем расчетная гибель 50% клеток наблюдается при фотообесцвечивании примерно на 35%.

Это подтверждается окрашиванием пропидиййодидом: при 20% фотообесцвечивании через 100 минут после абляции окрашивание пропидиййодидом практически отсутствует. Однако 50% фотообесцвечивание приводит к стойкому окрашиванию пропидиййодидом в абляционном эпителии спустя 60 минут. В то же время 30% и 40% фотообесцвечивание приводят к промежуточному уровню включения пропидиййодида.

После освоения эта техника может быть выполнена за 30 минут при соблюдении правильного порядка действий. Не забывайте, что работа с лазерами и химическими реагентами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как предотвращение прямого взгляда на лазерный луч и использование перчаток при работе с химикатами. После данной процедуры для получения ответов на дополнительные вопросы, направленные на изучение повреждения и восстановления почек на клеточном и молекулярном уровнях, могут быть применены другие методы, такие как таймлапс-микроскопия, иммунофлуоресцентное окрашивание и другие.

После разработки этот метод открыл новые возможности для исследователей в области регенерации почек. Целью данной работы является изучение роли коллективной миграции клеток и восстановления почек после повреждения у Zebrafish. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать конфокальную микроскопию для повреждения специфических сегментов почек у трансгенных личинок и эмбрионов Zebrafish с GPF.