Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Общая цель данной процедуры — измерение динамики микротрубочек в клетках дрожжей. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области изучения микротрубочек, например, о том, как мутации в тубулинах и регуляторах микротрубочек влияют на динамику микротрубочек в живой клетке. Основным преимуществом данной методики является стабилизация живых дрожжевых клеток при визуализации.

Точнее, высокое временное разрешение в течение десяти минут или низкое временное разрешение в течение нескольких часов. Процедуру продемонстрируют Колби Физ и Касси Эстрем, два аспиранта из моей лаборатории. Клетки дрожжей, использованные в этом эксперименте, были сконструированы для конститутивной экспрессии тубулина, меченого GFP.

Внесите около одного микролитра клеток дрожжей из одной колонии с чашки в три миллилитра синтетической полноценной среды. Инкубируйте клетки в течение ночи при 30 °C при встряхивании со скоростью 250 RPM. На следующий день разведите насыщенную культуру в среде до значения OD600 менее 0,1.

Верните разведенную культуру в шейкер при температуре 30 °C на три-четыре часа или до тех пор, пока OD600 не достигнет значений от 0,4 до 0,8. Приступите к подготовке предметных стекол для проточной камеры, вырезав из листа парафиновой пленки прямоугольник шириной четыре дюйма и длиной семь дюймов. Положите стандартное предметное стекло вдоль ширины пленки (четыре дюйма) и оберните пленку вокруг стекла три-четыре раза, чтобы стекло было покрыто слоем пленки толщиной в три-четыре слоя.

Прижмите слои друг к другу, чтобы обеспечить надежное уплотнение, стараясь не давить слишком сильно и не допускать образования складок на пленке. С помощью чистого лезвия канцелярского ножа и другого предметного стекла, которое послужит направляющей для ровного реза, обрежьте парафиновую пленку по внешним краям стекла. Снимите излишки пленки с рабочего стекла и утилизируйте их.

Используя второй предметный предмет в качестве линейки, разрежьте стопку слоев пленки вдоль длинной оси стекла примерно на 10 полосок шириной от двух до четырех миллиметров каждая. Затем разрежьте стопку слоев парафиновой пленки перпендикулярно предыдущим разрезам вдоль короткой оси стекла, чтобы получить полоски шириной от двух до четырех миллиметров, длиной от 23 до 24 миллиметров и толщиной от трех до четырех слоев. Используйте лезвие под углом 45 градусов, чтобы отделить разрезанные полоски пленки.

Затем с помощью пинцета равномерно распределите вырезанные полоски на чистом предметном стекле, чтобы создать необходимое количество камер. В данном примере для создания трех камер будут использованы четыре полоски пленки. Положите один покровный стеклик поверх полосок пленки и с помощью пинцета переместите его в нужное положение.

Поместите подготовленный предметное стекло покровным стеклом вверх на нагревательную плитку, установленную примерно на 95 °C, и нагревайте стекло в течение приблизительно трех минут, пока полоски пленки не станут полупрозрачными. Герметизируйте предметное и покровное стекла, осторожно нажимая пинцетом на области покровного стекла, расположенные непосредственно над полосками парафиновой пленки. С помощью пинцета снимите предметное стекло с нагревательной плитки и отложите его для охлаждения покровным стеклом вверх.

По мере охлаждения предметного стекла пленка снова станет белой и непрозрачной. Для начала этой процедуры разморозьте замороженную аликвоту Concanavalin A объемом 200 µL при комнатной температуре. Добавьте примерно 100 µL размороженного Concanavalin A в каждую камеру подготовленного предметного стекла, внеся раствор через один из открытых концов.

Затем подвесьте предметное стекло покровным стеклом вниз между двумя стойками для микроцентрифужных пробирок на пять минут, чтобы Concanavalin A мог прикрепиться к покровному стеклу. Верните предметное стекло в положение покровным стеклом вверх и удалите Concanavalin A, промыв камеру синтетической полноценной средой. Пропустите через камеру объем среды, равный двум объемам камеры, используя угол бумажного полотенца для вытягивания жидкости из одного конца камеры, одновременно внося свежую жидкость пипеткой в другой конец камеры.

Загрузите клетки, пропустив через камеру объем клеточной суспензии, в два раза превышающий объем камеры, используя метод направленного потока. Оставьте предметное стекло в подвешенном состоянии покровным стеклом вниз на 10 минут, чтобы клетки прикрепились к покровному стеклу. Удалите неприкрепившиеся клетки, промыв камеру синтетической полной средой в объеме, в четыре раза превышающем объем камеры.

Осторожно просушите каждый конец камеры чистым углом бумажного полотенца, подтянув мениск к краю покровного стекла. Герметизируйте каждый конец камеры теплым герметиком. Сбор изображений будет осуществляться с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного объективом 1.45 NA 100X CFI Plan Apo, пьезоэлектрическим столиком, сканирующим конфокальным блоком с вращающимся диском, лазером освещения и EMCCD-камерой.

Во время сбора изображений поддерживайте температуру предметного столика на уровне комнатной температуры. Настройте фокус и найдите на предметном стекле группы клеток, чтобы убедиться, что в поле обзора находится не менее пяти-шести клеток, расположенных в одной фокальной плоскости. Настройте многомерный сбор данных для регистрации нескольких z-серий в динамике.

Установите следующие параметры в активных настройках сбора данных: общая глубина по оси Z — 6 µm, чтобы охватить всю клетку дрожжей; шаг по Z — 300 nm для максимального сбора света без избыточного дискретизирования; общая продолжительность записи — 10 минут; временной интервал между z-сериями — 4 с; время экспозиции для каждого Z-слоя — 90 ms. Начните сбор данных, нажав кнопку Run, и дождитесь завершения всего 10-минутного цикла. Данные сохраняются в виде серии изображений; пример результата таймлапс-визуализации представлен здесь.

Начните анализ изображений, открыв ImageJ и перетащив полученный стек изображений непосредственно на панель управления. Импорт Bio-Formats начнется автоматически. Выберите «ОК», чтобы загрузить стек изображений как гиперстек.

С помощью функции ZProject преобразуйте каждый zSeries в двухмерную проекцию с максимальной интенсивностью. Примените медианный фильтр к стеку изображений для уменьшения спекл-шума, выбрав в меню Process подменю Filter и пункт Median. Введите 2,0 pixels в поле радиуса и нажмите Okay. Идентифицируйте клетки pre-NFA в поле зрения.

Для них характерны почки среднего размера и короткое веретено митоза длиной примерно от 1 до 1,5 µm. Начиная с первого временного интервала серии изображений, используйте инструмент «сегментированная линия» (segmented line), чтобы провести линию вдоль одного астрального микротрубочки от места её соединения с более интенсивно мечеными микротрубочками веретена до плюс-конца, расположенного в цитоплазме. Дважды щелкните по концу микротрубочки, чтобы завершить построение сегментированной линии.

Запишите результат измерения в таблицу результатов, используя функцию измерения путем нажатия кнопки M на клавиатуре. После проведения измерений для всех временных точек скопируйте данные из таблицы результатов, вставьте их в электронную таблицу и выберите «Save As» («Сохранить как») для сохранения данных. На этом графике показан временной ряд динамики астральных микротрубочек в клетке дикого типа и в мутантном штамме, в котором ранее была продемонстрирована большая стабильность микротрубочек.

Микротрубочки помечены GFP-меченым альфа-тубулином для визуализации их длины. Красные стрелки показывают общую длину астральной микротрубочки, а наконечники стрелок обозначают плюс-концы. Длина микротрубочек измерялась в каждой временной точке на протяжении восьми минут, и эти суммированные значения длины представлены на графиках выживаемости.

Зеленые точки обозначают полимеризацию, а розовые точки — деполимеризацию. События катастрофы отмечены стрелками. Эти графики показывают, что микротрубочка у мутанта длиннее и характеризуется меньшим количеством катастроф по сравнению с микротрубочкой дикого типа.

Кроме того, скорость полимеризации и деполимеризации, определенная по наклону графиков увеличения и уменьшения длины микротрубочек, у мутанта снижена по сравнению с диким типом. Измерения динамики микротрубочек также показывают, что микротрубочки в клетках мутанта обладают меньшей динамичностью по сравнению с диким типом. После освоения метода подготовка предметного стекла, нанесение клеток и получение изображений могут быть выполнены за 30 минут, что позволяет визуализировать множество различных образцов за один день.

Стеклянные камеры могут быть изготовлены и храниться заранее, до добавления конканавалина A. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как стабилизировать дрожжевые клетки в простых предметных камерах, осуществлять четырехмерную визуализацию и измерять динамику микротрубочек в живых клетках. Помимо микротрубочек, данную процедуру можно модифицировать для измерения динамики других флуоресцентно меченных белков в живых клетках дрожжей в временных масштабах от секунд до часов.