Name: Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Узнайте метод совместного осаждения для изучения взаимодействия белков с F-актином. Этот подход позволяет определить связывание и измерить аффинность взаимодействия с помощью ультрацентрифугирования и SDS-ПАГЭ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Грант HL127711 AVK.

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+Actin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li>
<li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li>
<li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins%3A+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li>
<li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li>
<li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li>
<li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.cshlpress.org/default.tpl?cart=148475793033306084&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=678">Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li>
<li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li>
<li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+gene+family%3A+function+follows+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li>
<li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li>
<li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+actin%3A+purification+and+single+molecule+assembly+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li>
</ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Анализ соосаждения актина является прямым методом, который позволяет быстро определить, связывает ли белок F-актин. С некоторыми модификациями методику можно также использовать для измерения аффинности взаимодействия. Помимо вопросов, затронутых в вышеуказанном протоколе, при проектировании, проведении и интерпретации анализа следует учитывать следующие вопросы. Интересующий белок Свежеприготовленный или замороженный белок может быть использован в анализе. Если используется замороженный белок, рекомендуется сравнить результаты с новым (никогда не замороженным) белком, чтобы гарантировать, что замораживание не влияет на связывание F-актина. Источник G-actin Во многих экспериментах с гранулированием G-актин изолирован от мышцы из-за ее относительного содержания. Существуют три главных изотипа актина у млекопитающих - альфа, бета и гамма - которые удивительно похожи (&gt; 90% идентичности последовательностити). Тем не менее, существуют функциональные различия между изотипами 12 , 13 . Если возможно, изотип G-актина, используемый в анализе связывания, должен соответствовать изотипу in vivo . Например, при тестировании белка, выраженного в скелетных мышцах, альфа-актин является лучшим выбором; Если исследуется белок, экспрессируемый в фибробластах, рекомендуется использовать бета-актин. Использование Phalloidin Поскольку фаллоидин связывает F-актин, он может мешать или даже блокировать связывание некоторых F-актин-связывающих белков ( например, блокирование фактоидином кофилина от связывания с актиновыми филаментами) 14 . Таким образом, фаллоидин следует использовать с осторожностью и результаты по сравнению с образцами, обработанными нефаллоидином, когда это возможно. Высокий фон Нередко белки осаждаются в отсутствие F-актина ( рис. 1А , без образца F-актина в таблеткахс). Однако высокие уровни фонового осаждения могут маскировать истинное соосаждение актина и затруднять, если не невозможно, определение того, связывает ли белок F-актин или измеряет аффинность взаимодействия. Добавление полидиканола в реакционный буфер (шаг 4.1) может значительно уменьшить фон и является простым решением. Если это не уменьшает фона, то может помочь корректировка реакционного буфера, концентрации соли и / или температуры инкубации. Кривая привязки Для создания кривой связывания необходимо варьировать концентрацию либо представляющего интерес белка, либо F-актина в течение ряда реакций. На практике легче и предпочтительнее поддерживать F-актин в фиксированной концентрации и варьировать концентрацию интересующего белка. Поддержание F-актина при фиксированной концентрации ( например, 2 мкМ) в анализе гранулирования ограничивает неспецифическое улавливание при более высоких концентрациях F-актина и предотвращаетДеполимеризации при более низких (&lt;0,5 мкМ) концентрациях F-актина. Деполимеризацию можно предотвратить с помощью фаллоидина, хотя это вводит потенциальный усложняющий фактор в систему (см. Шаг 3.3 и выше). Поддержание F-актина при фиксированной концентрации также позволяет сравнить (и нормализовать) гранулу F-актина по образцам и идентифицировать неудавшиеся эксперименты ( т.е. где осадок F-актина сильно варьирует, предотвращая анализ по концентрациям). Наконец, поддержание F-актина при фиксированной концентрации позволяет определить, является ли связывание с актиновой нитью кооперативной ( рис. 1С ). Насыщенный переплет Как и во всех экспериментах на связывание, очень важно, чтобы связывание с F-актином было насыщенным и что концентрация белков плюс F-актиновые плато ( рис. 1C ). Без плато невозможно вычислить точную константу равновесия диссоциации. Таким образом, онВажно тщательно планировать анализируемую серию разбавлений и всегда включать более высокие концентрации белка ( т. Е. По крайней мере в 5-10 раз выше, чем ожидаемый K d ). Анализ связывания Для того, чтобы измеренные константы диссоциации были окончательными, анализ следует проводить с использованием концентрации F-актина, которая позволяет концентрации сайтов связывания на F-актине для представляющего интерес белка быть значительно ниже, чем сродство. Чтобы проверить, был ли соблюден этот критерий, оцените концентрацию сайтов связывания от B max . Например, если [F-actin] составляет 2 мкМ и B max = 0,5, то [сайты связывания] ≈ 1 мкМ. K d должен быть по крайней мере в 5-10 раз больше, чем [места связывания]. Если измеренный K d имеет тот же порядок величины, что и [участки связывания], то возможно, что наблюдаемая кривая связывания представляет собой титрование связывания с высоким сродством siСкорее, чем истинная изотерма связывания. Если это наблюдается, повторите анализ, используя концентрацию F-актина в 10 раз ниже, чтобы измерить точную аффинность. Для высокоаффинных взаимодействий стабилизация фаллоидина (шаг 3.3) может быть необходима для достижения концентрации F-актина, достаточно низкой для точного измерения сродства. Наконец, существуют фундаментальные ограничения в методе совместного осаждения, которые должны быть известны исследователям при выполнении и оценке анализа. Самое главное, что анализ соосаждения не дает истинной константы равновесия. Продукты связывания ( т.е. белок плюс F-актин) отделяют от реагентов во время центрифугирования, после чего продукты могут диссоциировать для создания нового равновесия. В результате анализ совместного осаждения может ошибочно вычислять или не обнаруживать взаимодействия с низкой аффинностью. Поскольку многие актин-связывающие белки имеют низкое ( т.е. микромолярное) сродство к F-актину, отрицательный результат ( <eM&gt; т.е. не обнаруживается связывание) в анализе необязательно означает, что белок не связывает F-актин. В качестве альтернативы, исследования на основе микроскопии на основе TIRF с одной нитью более чувствительны и более точны для определения константы диссоциации (для обзоров по этой методике см. Ссылки 15,16 ). Несмотря на эти ограничения, метод грануляции находится в пределах возможностей большинства исследователей и является эффективным инструментом для определения, связывает ли белок F-актин и измеряет сродство взаимодействия.

Афин является важным белком цитоскелета, который играет критическую роль в множественных клеточных процессах, включая подвижность, сокращение, адгезию и морфологию 1 . Актин существует в двух формах: мономерный глобулярный актин (G-actin) и полимеризованный нитчатый актин (F-актин). Внутри клеток F-актиновая организация контролируется большим набором белков, которые регулируют зарождение, рост, сшивание и разборку актиновых филаментов 2 , 3 , 4 . Однако, как несколько актин-связывающих белков функционируют согласованно, чтобы регулировать организацию сети актина, все еще в значительной степени неясно. Измерение белково-белковых взаимодействий является важным подходом для понимания того, как белки оказывают влияние на клеточное поведение на биохимическом уровне. Для определения взаимодействия между очищенными белками можно использовать множество различных анализов.Общие подходы к растворимым белкам включают в себя срывы, поляризацию флуоресценции, изотермическую титровальную калориметрию и поверхностный плазмонный резонанс. Важно отметить, что для всех этих анализов требуется, чтобы белки были растворимыми и, таким образом, их трудно адаптировать для использования с полимерным волокнистым белком, таким как F-актин. Здесь мы описываем методику - коэдиентацию актина или гранулирование - анализ, чтобы определить, связывает ли белковый или белковый домен F-актин и измеряет сродство взаимодействия. Актин гранулирующий анализ является относительно простой техникой, которая не требует специального оборудования, кроме ультрацентрифуги. Все реагенты могут быть изготовлены, исходя из знания базовой биохимии или приобретены. После установления связывания с F-актином анализ можно использовать для измерения кажущейся аффинности ( т.е. константы равновесия диссоциации) 5 . Кроме того, после установления сродства, гранулирующий анализЯвляется полезным инструментом для измерения того, как изменения интересующего белка ( т.е. пост-трансляционные модификации, мутации или связывание лигандов) влияют на его взаимодействие с F-актином 6 . Метод имеет ограничения (см. Обсуждение ), о которых исследователь должен знать перед попыткой анализа.

<table><tbody><tr><td>Микроцентрифуга Sorvall MTX 150</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 ротор</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ультрацентрифуга пробирки - 0,2 мл</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Актин, скелетные мышцы кролика</td><td>Цитоскелет</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Бычья сыворотка Альбумин</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Полидиканол (Тезит)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Фаллоидин</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Дитиотреитол (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Аденозинтрифосфат (АТФ)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Имидазол</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Хлорид натрия (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Хлорид магния (MgCl2)</td><td>Хлорид калия Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>(KCl)</td><td></td><td></td>Этиленгликоль-бис<td></td></tr><tr><td>(&бета;-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Система визуализации Odyssey CLx</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Синий R-250 Краситель</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Набор для окрашивания коллоидным синим</td> цветом <td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

Измерение связывания белка с f-актином путем совместного осаждения

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Организация нитчатого актина (F-actin) внутри клеток регулируется большим количеством актин-связывающих белков, которые контролируют зарождение актина, рост, сшивание и / или разборку. В этом протоколе описывается методика - совместное осаждение актина или гранулирование - определение того, связывает ли белковый или белковый домен F-актин и измеряет аффинность взаимодействия ( т.е. константу равновесия диссоциации). В этом методе интересующий белок сначала инкубируют с F-актином в растворе. Затем для осаждения актиновых филаментов используют дифференциальное центрифугирование, и осажденный материал анализируют с помощью SDS-PAGE. Если интересующий белок связывается с F-актином, он будет осаждаться вместе с актиновыми филаментами. Продукты реакции связывания ( т.е. F-актин и представляющий интерес белок) могут быть количественно определены для определения аффинности взаимодействия. Актин гранулирующий анализ является прямым методом определенияЕсли интересующий белок связывает F-актин и для оценки того, как изменения этого белка, такие как связывание лиганда, влияют на его взаимодействие с F-актином.

Мы исследовали связывание гомодимера αE-катенина с F-актином в анализе ко-седиментации. Поскольку в прошлых экспериментах было показано, что сродство гомодимера αE-катенина для F-актина составляет около 1 мкМ, а B max около 11 , мы провели анализ с низкой концентрацией F-актина (0,2 мкМ, а не 2 мкМ, см. Дискуссия). Поскольку 0,2 мкМ ниже критической концентрации, для стабилизации F-актина, полимеризованного из G-актина скелетной мышцы кролика (шаг 3.3), добавляют фаллоидин. Увеличение концентрации гомодимера αE-катенина (0,125-12,0 мкМ) инкубировали в присутствии или в отсутствие 0,2 мкМ F-актина. Образцы центрифугировали и полученные гранулы анализировали ( фиг.1А ). Как и ожидалось, гомодимер αE-catenin, осажденный с F-актином выше фона ( рисунок 1A , сравните образцы гранул F-актина с no-F-acОбразцы олова). BSA был запущен как отрицательный контроль ( Рисунок 1B ). Связанный белок определяли количественно и наносили на график над свободным белком для расчета аффинности взаимодействия ( фиг.1С ). Построенные данные лучше всего соответствуют уравнению Хилла. Рассчитанный K d составлял 2,9 мкМ, B max - 0,2, а коэффициент Хилла (h) - 4,8. Таким образом, гомодимер αE-катенина связывает F-актин совместно с низкой микромолярной аффинностью, что согласуется с предыдущей работой (K d 2,9 μM против ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Рисунок 1: Высокоскоростное F-actin co-седиментационное исследование. ( A ) Увеличение концентрации (0,125-12,0 мкМ) гомодимера αE-катенина инкубировали с (левые панели) или без (правые панели) 0,2 мкМ F-актин, стабилизированный фаллоидип. Их инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали. Общее количество (7,5% исходного материала) и гранулированный материал (50% гранулированного материала) разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и окрашивали красителем Кумасси. ( B ) В качестве отрицательного контроля использовали 4 мкМ BSA. Всего и образцы гранул с (+) или без (-) F-актина разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и окрашивали красителем Кумасси. ( C ) Связанный αE-catenin (мкМ / мкМ актин) от A был нанесен на график против свободного αE-catenin (μM), и данные соответствовали уравнению Хилла (красная линия). Указаны коэффициенты K d , B max и Hill (h). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Рисунок 2: количественная оценка гранулирования актина </sTrong&gt; - блок-схема. Эта схема описывает основные этапы в разделе 5 с примерами образцов Total и Pellet ( A , CE ) и стандартной кривой ( B ), используемой для количественной оценки. 5.13 этапов: 1 ) Измерьте количество белка, представляющего интерес, в Всего образцов (A). 2 ) Создать стандартную кривую путем построения зависимости интенсивности полосы от массы белка (В). 3 ) Измерьте количество представляющего интерес белка, который был осажден с F-актином ( C ). 4 ) Измерьте количество представляющего интерес белка, который осаждали в отсутствие F-актина ( D ). 5 ) Вычтите D из C, чтобы определить количество белка, связанного с F-актином. 6 ) Измерьте количество F-актина в каждой таблетке (E), вычислите среднее количество F-актина на образец и разделите каждую пробу на среднее значение (числа ниже показывают отношение). 7 )Для каждого образца разделить количество связанного белка (рассчитанного на этапе 5) с отношением гранул F-актина (рассчитанное на этапе 6), чтобы скорректировать различия в осадке. 8 ) Используйте стандартную кривую ( B ) для расчета количества (массы) нормированного связанного белка в каждом образце (шаг 7). 9 ) Определите концентрацию свободного белка и связанного белка для создания кривой связывания. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Этот протокол описывает метод для проверки способности белка к совместному осаждению с нитчатым актином (F-actin) и, если связывание наблюдается, для измерения аффинности взаимодействия.

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Общая цель данного метода заключается в проверке способности белка совместно осаждаться с филаментозным актином и, в случае обнаружения связывания, в измерении сродства этого взаимодействия. Данный метод представляет собой простой способ определить, связывается ли белок с F-актином. Преимуществами этой методики являются отсутствие необходимости в специализированном оборудовании, помимо ультрацентрифуги, а также возможность изготовить или приобрести все необходимые реагенты.Для начала подготовьте белок высокой степени очистки согласно текстовому протоколу. Определите концентрацию белка, измерив поглощение при 280 нм. Непосредственно перед использованием центрифугируйте белок на высокой скорости для удаления агрегатов нерастворимого белка.Если возникает проблема с растворимостью, повторно измерьте концентрацию белка после центрифугирования. Затем извлеките аликвоту глобулярного актина или g-актина из морозильной камеры при -80 °C и быстро разморозьте ее. Добавьте 10X полимеризационный буфер к G-актину и разведите водой до конечной концентрации 1X.Инкубируйте смесь в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы актин полимеризовался. После полимеризации храните полимеризованный фибриллярный актин, или F-actin, в растворе при температуре 4 °C, где он будет оставаться стабильным в течение нескольких недель. Перед использованием F-actin после хранения осторожно переверните или встряхните пробирку несколько раз, чтобы убедиться, что весь актин растворен и равномерно распределен в растворе.Установите связывание исследуемого белка с F-актином, как описано в текстовом протоколе. После подтверждения связывания с F-актином проведите серийное разведение белка для создания серии концентраций, содержащей от семи до восьми образцов, в двукратной величине от конечной тестируемой концентрации. Например, если диапазон тестирования составляет от 0.1 до восьми мкМ, приготовьте в микроцентрифужных пробирках разведения белка с концентрациями 16, восемь, четыре, два, один, 0.5 и 0.2 мкМ в 1X реакционном буфере.Разведите исследуемый белок до конечной концентрации в 1X реакционном буфере в пробирках для ультрацентрифугирования. Добавьте F-actin в соответствующие образцы. Затем инкубируйте все образцы в течение 30 минут при комнатной температуре.Через 30 минут отберите одну пятую часть каждой пробы и смешайте с буфером для образцов. Это будут пробы общего содержания. Поместите пробирки для ультрацентрифугирования в ротор и центрифугируйте в течение 20 минут при 100,000 ×g и температуре 4 °C.После центрифугирования удалите три четверти супернатанта из каждой пробирки и смешайте его с 4X буфером для образцов в отдельной микроцентрифужной пробирке. Это будут пробы супернатанта. Удалите оставшийся супернатант с помощью наконечника для нанесения образцов на гель, стараясь не задеть осадок.Затем добавьте 1X буфер для образцов во все пробирки и инкубируйте не менее пяти минут при комнатной температуре. После инкубации подвергните образец тритурации от восьми до десяти раз с помощью наконечника дозатора p200, постоянно промывая область с осадком в пробирке. Во время тритурации осторожно заденьте наконечником дозатора осадок, чтобы облегчить ресуспендирование.Перенесите ресуспендированный белок в микроцентрифужную пробирку. Это образцы осадка. В завершение проанализируйте общие образцы и образцы осадка с помощью SDS-ПААГ.Проведите визуализацию гелей, окрашенных кумасси, с помощью системы имиджинга, которая измеряет интенсивность белковых полос в широком линейном диапазоне. Растущие концентрации гомодимера alpha e catenin инкубировали в присутствии или отсутствие 0.2 micromolar F-actin. Образцы центрифугировали, и полученные осадки анализировали.Как и ожидалось, гомодимер alpha e catenin ко-седиментировал с F-actin выше уровня фона. В качестве отрицательного контроля использовали BSA. Количество связанного белка было определено и отнесено к количеству свободного белка для расчета аффинности взаимодействия.Эту методику можно выполнить за четыре часа или менее, если F-actin уже полимеризован. При выполнении данной процедуры критически важно быстро удалить супернатант после центрифугирования и полностью ресуспендировать осадок. Как и в любых экспериментах по связыванию, крайне важно обеспечить насыщение связывания с F-actin и достижение плато чистоты вместе с F-actin; без выхода на плато невозможно точно рассчитать константу равновесия ассоциации.Метод коседиментации имеет фундаментальные ограничения, о которых исследователям следует знать; прежде всего, он не позволяет определить истинную константу равновесия и, как следствие, может привести к ошибкам в расчетах или невозможности обнаружения взаимодействий с низким сродством. Несмотря на эти ограничения, анализ коседиментации является доступным и эффективным инструментом для определения того, связывается ли белок с F-актином, а также для измерения сродства этого взаимодействия.

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Биохимия

Белки связываются с нитчатые актина (Ф-актин), через различные актина обязательные модули. В этом видео мы продемонстрируем процедуры актина совместного осаждения, которая в пробирке анализ обычно используется для анализа белков или конкретных областях, которые связывают F-актина.

Актина сотрудничества седиментации Пробирной; для анализа связывание белка с F-актин

Мы применяем без наклеек анализа взаимодействия белков использованием Biacore X100 для структуры и функции анализа связывания нескольких мутантов B цистатина к папаин через кинетические характеристики. Калибровка без анализа концентрации (ЦАФД) измеряет концентрацию белка с сохраненными связывающей активностью без необходимости использования стандартной кривой. Мы покажем, что подтверждение концентраций с использованием ЦАФД повышает надежность кинетического анализа и кинетических констант...

Важность правильной концентрации белка для кинетики и Affinity Определение в структурно-функционального анализа

В этом видео мы описываем метод флуоресцентной анизотропии для изучения взаимодействия между меченым флуорофором белком синдрома Швахмана-Даймонда (SBDS) и фактором удлинения, подобной 1 ГТФазе (EFL1). При инкубации белков SBDS с постепенно возрастающими концентрациями EFL1 наблюдается устойчивое увеличение анизотропии, что свидетельствует об успешном взаимодействии между двумя белками.

Обнаружение белок-белковых взаимодействий на основе флуоресцентной анизотропии

Полимеризация FtsZ необходима для деления бактериальных клеток. В этом отчете мы подробно описываем простые протоколы для мониторинга активности полимеризации FtsZ и обсуждаем влияние состава буфера. Протоколы могут быть использованы для изучения взаимодействия FtsZ с регуляторными белками или антибактериальными препаратами, влияющими на полимеризацию FtsZ.

FtsZ полимеризации Анализы: Простые протоколы и соображения

Этот протокол сравнивает относительное сродство партнеров по связыванию для ГТФаз семейства Rho, включая Rac1. In vivo Rac1-связывающие белки конкурируют за одну связывающую границу, конформация которой определяется связанным нуклеотидом. Нуклеотид важен и его трудно контролировать экспериментально из-за высокой скорости гидролиза.

Сравнение сродства GTPase-связывающих белков, используя конкурентных анализах

Белковых взаимодействий в основе функции клетки. Калориметрические и спектроскопические методы широко используются для их характеристики. Здесь мы опишем флуоресцентной анизотропии в качестве инструмента для изучения взаимодействия между белком мутировал в синдром Shwachman-DIAMOND (SBDS) и фактор элонгации типа 1 GTPase (EFL1).

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Мы представляем метод, который сочетает в себе очистку мембранного белка и восстановление в пептидиски в одном хроматографическом шаге. Биотинилатированные леса используются для прямого вложения поверхности и измерения взаимодействия белково-лигандов с помощью биослойной интерферометрии.

Pepti'uick, одноступенчатая инкорпорация мембранных белков в биотинилатированные пептидиски для оптимизированных белковых связывающих анализов

Этот протокол описывает образование поддерживаемых липидных бислоев и добавление цитоскелетных нитей и моторных белков для изучения динамики восстановленных, мембранно-привязанных цитоскелетных сетей с использованием флуоресцентной микроскопии.

Восстановление мембранно-привязанных минимальных актиновых коры на поддерживаемых липидных бислоях

Этот протокол описывает, как производить актиновые кометы на поверхностях шариков с использованием коммерчески доступных белковых ингредиентов. Такие системы имитируют протрузивные структуры, обнаруженные в клетках, и могут быть использованы для изучения физиологических механизмов производства силы упрощенным способом.

Восстановление подвижности на основе актина с помощью коммерчески доступных белков

Этот метод описывает анализ седиментации in vitro на основе лектина для количественной оценки сродства связывания глюканфосфатазы и амилопектина. Этот анализ совместного седиментации надежен для измерения связывания субстрата глюканфосфатазы и может применяться к различным солюбилизированным глюкановым субстратам.

Седиментационный анализ на основе конканавалина А для измерения связывания субстрата глюканфосфатаз

Было показано, что многие внутренне неупорядоченные белки участвуют в образовании высокодинамичных биомолекулярных конденсатов, что важно для многих клеточных процессов. В данной работе мы представляем метод количественной оценки динамики, с помощью которой белки взаимодействуют друг с другом в биомолекулярных конденсатах в живых клетках, основанный на визуализации одной молекулы.

Одномолекулярное измерение динамики взаимодействия белков в биомолекулярных конденсатах

Узнайте метод совместного осаждения для изучения взаимодействия белков с F-актином. Этот подход позволяет определить связывание и измерить аффинность взаимодействия с помощью ультрацентрифугирования и SDS-ПАГЭ.

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Больше видео