Мульти-отверстие криопробирку Исключает Замораживание Артефакты при мышечной ткани непосредственно погружали в жидкий азот

Общая цель данной процедуры — замораживание мышечных тканей путем их непосредственного погружения в жидкий азот с исключением артефактов замораживания. Маочжан Хэ, студент моей лаборатории, продемонстрирует эту процедуру вместе с Ичжуном Хуангом. Для начала подпишите идентификационные данные образца на каждой криопробирке.

Затем подготовьте следующее оборудование: сосуд с жидким азотом, защитные очки или лицевой щиток, криоперчатки, щипцы длиной 10 см и пинцет длиной 25 см. Также подготовьте пенопластовый контейнер, пластиковую пленку, скальпель и обложки для переплета из ПВХ формата А4. Чтобы подготовить образцы мышц, сначала наполните контейнер жидким азотом.

В течение пяти минут после получения образца осторожно поместите его на лист обложки для переплета из ПВХ формата A4 и определите направление мышечных волокон. Затем с помощью скальпеля сделайте два параллельных разреза через образец вдоль мышечных волокон длиной примерно 3 сантиметра с расстоянием между ними 0,6 сантиметра. Обрежьте вырезанную мышцу, чтобы получился прямоугольник шириной примерно 0,6 сантиметра, высотой 0,6 сантиметра и длиной 1,5 сантиметра.

Затем с помощью десятисантиметрового пинцета осторожно поместите образец на кусок пластиковой пленки так, чтобы продольная ось надрезанной мышцы была параллельна длинному краю пленки. Поместите мышечную ткань в нижнюю среднюю часть маркированной криопробирки, точно между входными отверстиями, и плотно закройте пробирку крышкой. Для замораживания образца ткани используйте двадцатипятисантиметровый пинцет, чтобы быстро погрузить всю криопробирку в жидкий азот в предварительно охлажденном пенопластовом контейнере; удерживайте пробирку до тех пор, пока жидкий азот не перестанет кипеть.

Количество жидкого азота должно быть достаточным для полного погружения криопробирки, чтобы она находилась полностью ниже уровня жидкости. Для длительного хранения перенесите образцы мышц в резервуар с жидким азотом или в морозильник при -80 °C. Важно избегать случайного контакта замороженных образцов мышц с контейнерами или инструментами комнатной температуры.

Для подготовки предметных стекол предварительно охладите криостат до температуры от 20 °C до 22 °C. Извлеките и утилизируйте старое лезвие микротома, затем протрите держатель ножа и антироликовую пластину в криостате. После этого установите в криостат новое лезвие микротома и установите толщину среза на 8 µm.

Извлеките криопробирку с образцом мышцы из контейнера с жидким азотом или из морозильной камеры при -80 °C и поместите её в жидкий азот или на сухой лед. Затем перенесите образец в криостат и подождите 30 минут, чтобы образец уравновесился по температуре с криостатом. После заливки образца в OCT закрепите его в держателе для образцов.

Затем изготовьте срезы толщиной 8 мкм. Закрепите срезы по центру предметного стекла комнатной температуры. Немедленно поместите предметное стекло в контейнер для хранения.

Затем поместите контейнер со стеклами в морозильную камеру при температуре -80 °C. Не допускайте высыхания стекла при комнатной температуре. Как видно здесь, при помещении образца мышцы longissimus dorsi свиньи непосредственно в морозильную камеру при температуре -80 °C образовались кристаллы льда, что привело к возникновению известного «эффекта швейцарского сыра» на криосрезе мышцы.

Кристаллы льда также образовывались при непосредственном погружении мышечной ткани в жидкий азот. При использовании другого метода в цитоплазматическом компартменте миофибрилл образовывалось множество игольчатых кристаллов льда, когда ткань погружали в среду для заморозки OCT в правильной ориентации, а затем быстро замораживали в суспензии изопентана. Замораживание ткани в многоперфорированной криопробирке обеспечивает отличную целостность образца с четко видимым цитоплазматическим компартментом и плотным прилеганием миофибрилл к окружающей ткани.

С помощью данного метода был проведен анализ активности АТФазы в быстросокращающихся и медленносокращающихся мышечных волокнах. При одинаковом времени воздействия быстросокращающиеся волокна окрашиваются в светлые тона (вторая степень), а медленносокращающиеся — в черный цвет. В стандартном методе замораживания, показанном здесь, мышечная ткань погружалась в суспензию изопентана без прямого контакта с mounting medium OCT, однако поддерживать изопентан в состоянии твердожидкой суспензии более одного часа затруднительно, а сам изопентан доступен не всегда.