Лапароскопическая Техника для последовательного Сборнике печени и мезентериальных лимфоузлов макак

Общая цель этой минимально инвазивной лапароскопической процедуры заключается в улучшении оценки эффектов микробной транслокации из желудочно-кишечного тракта путем сбора брыжеечных лимфатических узлов и биопсии печени в несколько временных точек при одновременном улучшении условий содержания животных. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии ВИЧ об иммунологических последствиях инфекции и микробной транслокации на брыжеечных лимфатических узлах и печени, а также патологии этих тканей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить отбор проб в нескольких временных точках исследования с минимальным воздействием на животное или на оцениваемые параметры.

Этот метод может предоставить образцы, имеющие решающее значение для углубления нашего понимания ВИЧ. Он также может быть применен к другим моделям, где важны воспаление желудочно-кишечного тракта и микробная транслокация. Проводить процедуру будут доктор Джереми Смедли и доктор Кэсси Моутс, ветеринарные хирурги из Вашингтонского национального исследовательского центра приматов.

После подготовки макаки к операции, как указано в текстовом протоколе, накройте ее стерильной фенестрированной простыней. Далее, используя стерильную драпировку для камеры, плотно накройте цифровую камеру и подключите ее к башне. Соедините жесткий прицел с головкой камеры.

Затем прикрепите стерильный световой кабель к жесткому эндоскопу и подключите его к источнику света. Наконец, установите стерильную инсуффляционную трубку на инсуффлятор. Чтобы начать лапароскопию, расположите лезвие скальпеля 15 примерно в одном-двух сантиметрах слева от пупка и сделайте примерно 5-миллиметровый колющий разрез на коже, которая доходит до мышц живота.

Недоминантной рукой поднимите брюшную стенку на краниальной стороне разреза. Затем другой рукой введите через разрез кончик варусной иглы, наклоненный к голове животного. Держите варусную иглу за стержень и сильно надавливайте на нее до тех пор, пока она не прощёлкнет брюшную стенку и сопротивление игле в брюшной полости не уменьшится.

Затем присоедините трубку инсуффлятора CO2 к игле и откройте запорный кран, чтобы выпустить газ в брюшную полость. Создать пневмоперитонеум можно путем достижения давления до 10-12 миллиметров ртутного столба. Теперь, когда брюшная полость полностью инсуффляирована, поместите лезвие скальпеля 15 над левой черепной брюшной полостью, примерно на два-четыре сантиметра каудально до последнего ребра, и сделайте примерно пять-семь миллиметровых надрезов кожи.

Далее вставляем через срез пятимиллиметровый троакар в сборе. Введите сборку на глубину от одного до двух сантиметров, направляя ее примерно под углом от 45 до 60 градусов каудомедиально. Затем вращательным движением сдвиньте канюлю вперед, достигнув глубины от 1,5 до трех сантиметров, чтобы вкрутить канюлю в брюшную полость.

После этого снимите троакар. Отсоедините трубку инсуффлятора от варусной иглы и после этого выключите запорный кран. Подсоедините трубку к канюле и откройте запорный кран для поддержания пневмоперитонеума.

Убедившись, что давление успешно поддерживается, снимите варусную иглу. Далее через канюлю введите жесткий эндоскоп в брюшную полость. Под контролем камеры углубляют разрез кожи, оставшийся после удаления варусной иглы, разрезая мышцы живота и брюшину.

Наконец, расположите животное так, чтобы ноги были подняты примерно на 15-30 градусов над головой. Для забора биопсии из брыжеечного лимфатического узла через подготовленный разрез в брюшную полость вводят твердый зонд. Поместите зонд между сальником и кишечником и мягкими размашистыми движениями обнажите кишечник от сальника, чтобы визуализировать брыжейку, которая скрыта внизу.

Продолжайте перемещать зонд из каудального в краниальное, чтобы оттолкнуть сальник от операционного поля. Затем с помощью зонда сдвиньте нисходящую ободочную кишку по направлению к брюшной стенке. Осмотрите брыжейку с помощью зонда, чтобы обнаружить брыжеечные лимфатические узлы, расположенные вдоль толстой кишки и брыжеечных сосудов.

Как только лимфатический узел будет идентифицирован, замените зонд в брюшной полости щипцами с храповым механизмом Мэриленда и захватите брыжейку, прилегающую к узлу. Потяните брыжейку к разрезу и извлеките эндоскоп из канюли. Затем выключите инсуффлятор и оставьте запорный кран канюли открытым, чтобы выпустить газ из брюшной полости, что облегчит экстериоризацию брыжейки.

Затем протяните брыжейку через разрез. Захватите внешнюю брыжейку щипцами, чтобы обеспечить доступ через разрез. Пальпируйте или наблюдайте за брыжейкой, чтобы определить лимфатический узел, который должен выглядеть как более твердый узел или более серая область.

Далее с помощью изогнутых гемостатиков сделайте трех-пятимиллиметровое отверстие в брыжейке, прилегающей к узлу, и тупо рассеките любые прикрепления к ткани. При необходимости перевязать сосудистую сеть нерассасывающимся монофиламентным швом 4-0 и с помощью скальпеля рассечь лимфатический узел. Затем поместите биопсию в среду RPMI 1640 на лед.

Наконец, освободите брыжейку и снова вдохните брюшную полость, чтобы дать возможность оттянуть ткань обратно в брюшную полость. Верните стол в горизонтальное положение. Для забора биопсии печени вводят канюлю с резьбой в брюшную полость через разрез, используемый для сбора лимфатических узлов.

Затем с помощью канюли вставьте жесткий эндоскоп, направленный в сторону брюшной полости черепа, чтобы визуализировать печень. Под контролем камеры вводят биопсийные щипцы через канюлю, ранее использовавшуюся для инсуффирования брюшной полости. Расположите щипцы ниже обозначенного края доли печени так, чтобы их челюсти были обращены к ткани, и откройте щипцы, позволив краю упасть в челюсти.

Отрегулировав их положение, закройте щипцы и сохраняйте давление в течение примерно 20-30 секунд. Затем извлеките образец, аккуратно протянув щипцы через канюлю. Поместите биопсию в среду RPMI на лед.

Наконец, убедитесь, что в месте проведения биопсии не наблюдается кровоизлияния, и закройте разрезы. Здесь представлены клеточные выходы, полученные из биопсий брыжеечных лимфатических узлов и печени, собранных у двух здоровых самок в двух разных временных точках. Как и ожидалось, биопсия лимфатических узлов дала значительно большее количество выделенных клеток по сравнению с биопсией печени.

Независимо от исходной ткани, более 85% выделенных клеток были жизнеспособными. Затем выделенные образцы клеток были проанализированы на популяции CD45+лейкоцитов и CD45+CD3+лимфоцитов. Брыжеечные лимфатические узлы имели большую частоту CD45+лейкоцитов и CD3+лимфоцитов по сравнению с клетками, полученными из печени.

Детальная характеристика изолированных популяций показала, что брыжеечные лимфатические узлы содержат значительно более высокую долю CD3+T-клеток и CD4+T-клеток, а также повышенное количество CD8+T-клеток. И наоборот, печень была значительно обогащена CD14+ лейкоцитами. Оба органа продемонстрировали сходное обилие CD20+B клеток.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 30-40 минут. Животные, как правило, восстанавливаются после анестезии, активны и едят в течение нескольких часов, а разрезы настолько малы, что их может быть трудно разглядеть со стороны клетки. При попытке выполнить эту процедуру важно поддерживать животных в таком состоянии, которое будет способствовать успеху.

Значительное количество жира брыжейки может быть сложным препятствием, поскольку он скрывает узлы и увеличивает жаркость и кровоточивость. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как флеботомия, биопсия периферических лимфатических узлов, эндоскопия верхних и нижних отделов желудочно-кишечного тракта и ректальная биопсия, чтобы оценить системные и слизистые иммунные реакции, состояние микробов и эпителиальных барьеров, а также вирусную нагрузку. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в нашей лаборатории к изучению микробных популяций при воспалении в продольном направлении в тканях макак, которые ранее были доступны только при вскрытии.

Применение этого метода распространяется и на терапию ВИЧ, поскольку микробная транслокация является основной причиной воспаления, которое приводит к патогенезу ВИЧ. Последовательная оценка может дать потенциальные мишени и позволить оценить терапевтические вмешательства. Не забывайте, что работа с любыми зараженными вирусом макаками может быть чрезвычайно опасной.

Должны быть доступны такие меры предосторожности, как надлежащая подготовка к биологически опасным факторам, включая вирус герпеса макакезина 1, надлежащие средства индивидуальной защиты, наборы для защиты от укусов и царапин, а также надлежащее медицинское наблюдение.