Оценка первичного взрыва эффекты в пробирке

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы генерировать репрезентативные ударные волны, которые могут возникать во время взрывных событий, и оценить влияние этого механического удара на жизнеспособность первичных клеток в культуре. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы, связанные с реакцией отдельных типов клеток на высокоэнергетические события, такие как воздействие ударной волны. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет нам оценить различные реакции клеток на одну ударную волну в отличие от реакций на уровне тканей или органов.

Применение этого метода распространяется на выявление клеточных механизмов, измененных в результате первичных взрывных повреждений, вызванных воздействием ударной волны. Несмотря на то, что этот метод демонстрируется на конкретном типе клеток, любые клетки могут быть культивированы и помещены в тестовую установку для оценки специфических для клеток реакции на ударную волну. Для начала культивируйте интересующую клеточную линию в стандартной культуре до тех пор, пока они не достигнут 80% конфлюенции.

Затем аспирируйте среду. Дважды промойте клетки PBS, и добавьте два миллилитра Трипсина-ЭДТА. Инкубируйте их в стандартных условиях культуры в течение пяти минут.

Кратко проверьте, чтобы убедиться, что клетки успешно диссоциировались от колбы. А затем добавить в колбу четыре миллилитра FBS, содержащей питательную среду, чтобы нейтрализовать трипсин и перенести клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку. Центрифугируйте ячейки при 200-кратном избежании в течение четырех минут, чтобы гранулировать клетки.

Затем медленно отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не выбить гранулу. И ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах среды. Поместите три маркированные 35-миллилитровые посуды внутрь 90-миллилитровой посуды.

Затем добавьте по два миллилитра среды в каждое блюдо и засейте в каждом по 70 тысяч клеток. Инкубируйте клетки в течение ночи, чтобы обеспечить адекватное прикрепление клеток, прежде чем подвергать их воздействию ударной волны. Перед началом сборки ударной трубки наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая рабочие ботинки со стальным носком и лабораторный халат.

Начните со вставки двух выравнивающих стержней через отверстия для болтов, расположенные в горизонтальной плоскости выпускного фланца. Затем поместите лист нитриловой резиновой прокладки на конец выравнивающих стержней так, чтобы он находился между выходным фланцем и установкой для культивирования органов ex vivo. Прикрепите оснастку EVOC к выпускному фланцу амортизаторной трубы, сдвинув приспособление по регулировочным стержням.

Убедитесь, что она правильно ориентирована, чтобы секция, в которой находится чашка Петри, располагалась у ее основания. Затем вставьте четыре болта и шайбы M24 в оставшиеся отверстия и плотно закрепите гайки и болты последовательно по диагонали, визуально проверяя, что оснастка EVOC и амортизаторная труба успешно выровнены. Затем прикрепите датчик давления к буровой установке EVOC и подключите его к источнику тока с помощью кабеля датчика.

Кроме того, используйте кабель BNC для подключения источника тока к осциллографу. Убедитесь, что все выпускные клапаны и регуляторы потока на амортизаторе закрыты. Затем откройте встроенную внешнюю сжатую воздуховоду и вручную поверните регулятор давления по часовой стрелке, чтобы зарядить соленоид до 2,5 бар.

Откройте баллон со сжатым воздухом, затем медленно поверните регулятор давления по часовой стрелке, чтобы увеличить давление примерно до 15 бар. Далее подготовьте диафрагмы, разрезав пластиковый лист толщиной 0,125 миллилитра на квадраты размером 10 на 10 сантиметров. Создайте ручки из скотча, и закрепите их в верхней и нижней части диафрагмы.

Используйте их, чтобы аккуратно расположить диафрагму рядом с передним небольшим фланцем у казенной камеры. Перед закрытием казенной части убедитесь, что мембрана находится прямо и правильно расположена. А затем закрепить его на месте с помощью четырех болтов и гаек М24.

Внутри стерильной вытяжки подготовьте клейкие газопроницаемые мембраны так, чтобы каждая была достаточно большой, чтобы покрыть верхнюю часть одной 35-миллилитровой чашки Петри. Затем перенесите 90-миллилитровую чашку Петри, содержащую три экспериментальных образца, в вытяжку. Отсадите среду из одной из посуды и накройте ее двумя мембранными секциями, обеспечив плотное прилегание между мембраной и краем посуды.

Перенесите образец в буровую установку EVOC и закрепите его на основании приспособления так, чтобы верхняя часть чашки была выровнена с внутренним основанием амортизатора. На этом этапе наденьте защитные наушники, очки для глаз, защитные ботинки и лабораторный халат. Нагнетайте давление в системе амортизаторов, поворачивая ручку регулировки расхода на регуляторе по часовой стрелке.

В нижней части панели управления выберите либо впуск с двойным затвором для короткой ударной волны, либо впуск для трубки водителя для увеличенной продолжительности волны. Затем включите источник питания постоянного тока и осциллограф, чтобы получить данные осциллограммы. Далее включите свет безопасности с помощью выключателя на стене напротив пульта управления, чтобы оповестить других исследователей о том, чтобы они не входили в помещение во время зарядки электрошоковой трубки.

На блоке управления соленоидом нажмите переключатель, чтобы закрыть соленоид. Затем на панели управления медленно откройте регулятор потока, поворачивая ручку против часовой стрелки, чтобы постепенно увеличивать давление в камере сжатия. Когда разрывное давление мембраны будет достигнуто, мембрана разорвется, и раздастся хлопок.

Как только этот шум станет слышен, быстро закройте ручку регулировки потока. Затем откройте соленоид, выключив переключатель на блоке управления соленоидом, и выключите свет безопасности. Перенесите образец клетки в стерильный колпак.

Там снимите клейкую газопроницаемую мембрану, и наполните посуду двумя миллилитрами свежей питательной среды. Добавьте по 200 микролитров реактива для окислительно-восстановительного потенциала в каждую экспериментальную посуду сразу после заправки их двумя миллилитрами свежей питательной среды. Затем перенесите блюдо в стандартный инкубатор на четыре часа.

После инкубации переложите по две 100-микролитровые аликвоты из каждой чашки в соответствующую 96-луночную тарелку. Прочитайте пластину на считывателе флуоресцентных пластин, а затем экспортируйте и сохраните данные. Для флуоресцентной визуализации живых и мертвых клеток клетки должны быть первоначально нанесены на стеклянную крышку внутри 35-миллилитровых культуральных планшетов.

После ударно-волновой терапии аспирируйте среду и дважды промойте клетки в одном миллилитре PBS. Затем перенесите 100 микролитров реагента живого мертвеца из набора для визуализации в каждый образец. А клетки и реагент инкубируйте при комнатной температуре, защитите его от света в течение 15 минут.

После инкубации извлеките реагент, и промойте клетки один раз, используя один миллилитр PBS. С помощью тонконаправленных щипцов осторожно снимите защитный листок с 35-миллилитровой посуды и положите его лицевой стороной вниз на предметное стекло для микроскопии. Получение изображений для каждого образца осуществляется с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом с 5-кратным увеличением и числовой апертурой 0,25.

Затем используйте программное обеспечение для анализа изображений, чтобы вручную или автоматически подсчитать количество живых зеленых и красных мертвых клеток на каждом изображении. Используя описанный здесь метод, клетки, выращенные в монослое, подвергались воздействию ударных волн, генерируемых ударной трубкой. Датчики в амортизаторе отображают профили давления, наблюдаемые в разных местах вдоль трубки.

С помощью окислительно-восстановительного анализа показаний было обнаружено, что применение 127-килопаскальной ударной волны способно значительно снизить жизнеспособность клеток дермального сосочка по сравнению с контрольной группой после 24 часов в культуре. Применение ударной волны с силой 72 кПа или менее не снижало жизнеспособность. В подтверждение этих наблюдений анализ живых мертвецов также продемонстрировал снижение жизнеспособности клеток у тех, кто подвергся воздействию 127-килопаскальной ударной волны по сравнению с контрольной группой.

После освоения эта техника может быть выполнена с переменной скоростью 60 образцов в час. Ударная трубка может использоваться для генерации ударных волн для исследования ряда первичных взрывных травм. Они могут варьироваться от бластного легкого до гетеротопической оссификации, которая представляет собой неправильное формирование кости в мягких тканях тела.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о рисках, связанных с работой со сжатыми газами и высокоэнергетическими ударными волнами, и всегда следовать правильным правилам безопасности. Незначительные изменения в ударной трубке могут позволить нам изменить ударную волну. Затем мы можем оценить реакцию ячеек на различные профили давления и интенсивности, которые представляют различные сценарии взрыва.

После этой процедуры можно провести секвенирование нового поколения, чтобы ответить на дополнительные исследовательские вопросы, такие как: Как воздействие ударной волны изменяет нашу естественную запись в клетках?