Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии живых или фиксированных и окрашенных Tribolium castaneum Эмбрионы

Общая цель этого протокола заключается в наблюдении за неинвазивным развитием эмбрионов Tribolium castaneum в течение очень длительных периодов времени. Флуоресцентная микроскопия на основе световых листов помогает ответить на вопросы, связанные с морфогенезом в новом модельном организме насекомых Tribolium castaneum, рассматривая закономерности миграции и пролиферации клеток от ранней бластодермы до начала мышечного движения. Главное преимущество этого метода заключается в том, что такие критические факторы, как фотообесцвечивание и фототоксичность, сведены к минимуму даже при наблюдении за эмбрионами в течение нескольких дней.

Чтобы поместить эмбрион в камеру для образцов с помощью агарозной колонки, сначала наполните одномиллиметровый шприц дистиллированной водой и с помощью небольшого резинового шланга прикрепите шприц к стеклянному капилляру. Заполните капилляр наполовину дистиллированной водой, затем с помощью малярной кисти перенесите зародыш на внутреннюю сторону стеклянного отверстия капилляра и вставьте капилляр в жидкую агарозу, медленно втягивая несколько микролитров агарозы вместе с зародышем в капилляр. Когда эмбрион находится на месте, должно быть несколько микролитров агарозы как выше, так и ниже эмбриона.

Когда агароза застынет, укоротите капилляр до длины около пяти миллиметров. Оставшийся фрагмент должен быть полностью заполнен агарозой и зародыш должен быть обнаружен в пределах второго квартиля. Затем вставьте стальной цилиндр со штифтом в камеру для образца, и воткните капиллярный фрагмент поверх штифта, Агарозная колонна должна выступать на несколько миллиметров от области капиллярного фрагмента, в котором находится зародыш.

Чтобы установить эмбрион в камеру для образцов с помощью полусферы с агарозой, сначала наберите 200 микролитров жидкой агарозы в одномиллиметровый шприц и с помощью шприца заполните стальную трубу с камерой образца агарозой с верхней части трубы, пока в нижнем отверстии не образуется полусфера. Когда агароза застынет, возьмите эмбрион кончиком кисти и переставьте эмбрион так, чтобы передний конец стал доступен. Опустите Agarose Hemisphere в жидкую Agarose, чтобы покрыть полушарие тонкой пленкой, и поместите эмбрион передним концом вертикально на полюс Agarose Hemisphere.

Поверните стальную трубу и при необходимости с помощью щетки откорректируйте положение эмбриона. В идеале агарозой должно быть покрыто менее половины поверхности зародыша, а бока должны быть как можно более крутыми. Слишком большое количество агарозы на поверхности эмбриона приводит к механическому сужению и снижению газо- и ионного обмена, что оказывает значительное влияние на выживаемость эмбриона.

Затем медленно вставьте стальную трубу в камеру для образцов. Чтобы установить эмбрион в камеру для образцов с помощью держателя для паутины, сначала выберите эмбрион с помощью кисти и отложите кисть в сторону. Затем закройте щелевое отверстие держателя паутины пятью-восемью микролитрами жидкой агарозы, затем удалите большую часть агарозы, пока не останется только тонкая агарозная пленка.

Поместите эмбрион на агарозную пленку и отрегулируйте его положение, осторожно перемещая эмбрион к центру оси X щелевого отверстия и выравнивая его вытянутую переднюю заднюю ось с удлиненной осью щелевого отверстия. Обязательно поместите эмбрион на агарозную пленку в течение 10-15 секунд после ее наложения, то есть пока агароза еще жидкая, иначе она не прилипнет должным образом. Затем медленно вставьте держатель «Паутины» в камеру для образцов, расположив держатель так, чтобы он не мешал возбуждению и излучению света.

Для анализа изображений в реальном времени сначала настройте интервальную съемку, затем в режиме пропускающего света расположите эмбрион по осям X и Y в центре поля зрения, не подвергая эмбрион воздействию лазера. Поверните эмбрион на 360 градусов с шагом 90 градусов, чтобы осмотреть ткань на предмет повреждений, которые могли произойти в процессе монтажа. В режиме флуоресценции определите Z-стек для каждого направления, добавив пространственный буфер размером от 25 до 50 микрометров перед и позади эмбриона, и определите расстояние Z.

Для долгосрочной визуализации убедитесь, что камера образца заполнена достаточным буфером для визуализации и закройте отверстие камеры для образца. Затем начните процесс визуализации, контролируя правильность получения данных по всем направлениям во всех каналах для всех эмбрионов. По окончании периода визуализации извлеките держатель образца из камеры для образцов и перенесите эмбрион на предметное стекло.

Если использовалась агарозная колонка, используйте острое лезвие, чтобы извлечь зародыши из окружающей агарозы. Если использовалась агарозная полусфера, перенесите полусферу плоской стороной на предметное стекло. Для метода держателя паутины с помощью малярной кисти аккуратно отделите эмбрион от агарозной пленки.

Затем инкубируйте зародыш загруженного объекта, столкайте в небольшую стеклянную посуду в атмосфере насыщенной влажности в стандартных условиях до тех пор, пока не вылупятся личинки. Чтобы обработать данные наблюдаемого эмбриона, откройте интересующие файлы в соответствующем программном обеспечении для анализа изображений и поверните Z-Stacks, чтобы выровнять переднюю заднюю ось эмбриона по оси Y по мере необходимости. Обрежьте Z-стеки вдоль осей X и Y так, чтобы остался только минимальный фон, затем рассчитайте максимальную проекцию Z для каждого Z-стека.

Затем, в зависимости от трансгенной линии и методов визуализации, выполните соответствующие динамические корректировки интенсивности временных стеков для коррекции любого фотообесцвечивания или флоры для флуктуаций мимики, если это необходимо. С использованием трансгенной линии, экспрессирующей гибридный белок Histon 2B M-Emerald под контролем промотора альфа-тубублина one, было зарегистрировано 66 часов эмбрионального развития при комнатной температуре от ретракции зародышевой полосы до дорсального закрытия. Эта ловушка-усилитель может быть использована для визуализации нейронных кластеров в придатках головы и динамики миграции циррозы во время дорсального закрытия.

При визуализации аналогичной трансгенной линии, несущей тот же трансген, но в другом месте генома, оптические срезы перехода от гаструляции к удлинению зародышевой полосы показывают внутреннее клеточное расположение возникающей зародышевой полосы. Использование глиально-голубой трансгенной линии получение Z-стеков в нескольких направлениях путем вращения образца позволяет наблюдать реорганизацию глиальных клеток вдоль и вокруг вентрального нервного канатика, а также динамику их пролиферации дорсальной стороны долей головы у одного и того же эмбриона. Малые флуоресцентные красители также могут быть использованы для специфического мечения межклеточных структур, чтобы выделить определенные эмбриональные особенности, такие как циррозный газ, задние вентральные циррозные клетки или трислой ткани гермальной полосы серозного амниона, который появляется во время закрытия окна серозы.

Двухцветное окрашивание флуоресцентным красителем позволяет в дальнейшем визуализировать две межклеточные структуры в одном и том же эмбрионе. Например, актиновый цитоскелет и ядерная оболочка. После того, как запись завершена, важно, чтобы контроль качества эксперимента получил эмбрионы и вырастил их до здоровых фертильных взрослых особей.

Эту процедуру можно сочетать с другими методами, такими как Родительская разница РНК для анализа сбитых фенотипов.