Использование фенотипированного бокового популяционного фенотипа ДНК для обнаружения и очистки раковых стволовых клеток от биологических образцов

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении предполагаемых популяций раковых стволовых клеток в биологических образцах на основе экструзионной способности красителя клеток боковой популяции. Этот метод решает ключевой вопрос в исследованиях раковых стволовых клеток, касающийся надежных средств обнаружения и очистки раковых стволовых клеток из биологических образцов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она развертывает функциональные маркеры и, следовательно, обеспечивает лучшее разрешение.

Кроме того, экспрессия этих транспортеров ABC высоко консервативна среди раковых стволовых клеток, и поэтому мы можем использовать эту технику для многих различных раковых образований. Применение этого метода распространяется на открытие противораковых препаратов для лечения стволовыми клетками, поскольку он облегчает последующий анализ, такой как профилирование экспрессии генов и валидация мишени в высокоочищенных раковых клетках. Таким образом, этот метод может дать представление о характеристиках раковых стволовых клеток.

Мы также можем использовать этот метод для характеристики системы, содержащей ABC-транспортер лекарственных средств, экспрессирующих популяции, такие как костный мозг. Демонстрировать процедуру будет Элизабет Хофленер, техник из моей лаборатории. Для начала культивируйте желаемую линию раковых клеток человека при температуре 37 градусов Цельсия в 10-30 мл среды RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, двух миллиметровых L-глутамина и антибиотиков.

Когда клетки достигнут примерно 70-90% конфлюенции, удалите среду и добавьте два миллилитра 0,05% трипсина-ЭДТА, чтобы отделить клетки от поверхности чашки для культивирования. Затем промойте клетки 10 миллилитрами питательной среды, переложите суспензию в чистую 15-миллилитровую пробирку и вращайте ее при температуре 250 раз G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После того, как клетки будут гранулированы, выбросьте супренамент и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре питательной среды.

Смешайте небольшую аликвоту клеточной суспензии с раствором трипанового синего и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Для приготовления тестовых образцов суспензируют клетки в свежей питательной среде до получения клеточной суспензии в количестве от десяти до шести клеток на миллилитр. После регулировки плотности клеток переложите три миллилитра образца в пробирку с круглым дном объемом 15 миллилитров с надписью «тест».

Затем добавьте в образец 10 микромоляров фиолетового красителя и аккуратно сделайте вихревой суспензию. Затем приготовьте контроль ингибирования, перенеся 500 микролитров красителя, содержащего клеточную суспензию, в две пробирки проточной цитометрии, помеченные как контрольные. Добавьте к первому 50 микромоляров Верапамила.

И 20 микромоляров Фумитреморгина С во вторую трубку. И перемешайте растворы с помощью аккуратного пипетирования. Накройте все пробирки крышками и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в темноте в течение 90 минут.

Осторожно взбалтывайте образцы каждые 15 минут. Как только окрашивание будет завершено, промойте регуляторы ингибирования в трех-четырех миллилитрах ледяного PBS. И подготовить аликвоты исследуемого образца для последующего обогащения антителами.

Промойте эти аликвоты и отфильтруйте все образцы через ситечки, срезанные 70 микрон, чтобы удалить потенциальные клеточные агрегаты. А затем центрифугируют суспензии при 250-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После повторного суспендирования полученной гранулы в 100 микролитрах PBS, поддерживайте клетки на льду в защищенном от света месте.

Затем добавьте соответствующую панель конъюгированных антител флурохрома к клеткам, предварительно окрашенным фиолетовым красителем. Сделайте суспензию вихревой и инкубируйте ее при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в течение 20-30 минут. После инкубации промойте клетки в трех-четырех миллилитрах ледяного PBS, при желании отфильтруйте образец.

А затем центрифугировать при 250-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные клетки в 100 микролитрах PBS. Наконец, добавьте 7-AAD в клетки, предварительно окрашенные фиолетовым красителем.

И инкубируйте образцы в течение пяти-10 минут в темноте. Чтобы проанализировать клетки с помощью проточного цитометра, закрутите соответствующую популяцию клеток на точечную диаграмму FSC SSC. Затем, используя разные сигналы FSC, исключить из выбранной популяции все агрегаты клеток.

Исключите клетки с положительным окрашиванием 7-AAD для получения популяции жизнеспособных клеток. Чтобы создать точечную диаграмму для излучения синего и красного красителя, отобразите синий флуоресцентный канал по оси y и красный флуоресцентный канал по оси x. Переключите оба канала в линейный режим и отрегулируйте напряжение детектора таким образом, чтобы боковое население находилось в нижней левой части графика.

Затем определите популяцию сторон. И прекратить приобретение. Затем загрузите элементы управления ингибицией и получите данные.

Наконец, создайте точечную диаграмму, отображающую красное флуоресценцию фиолетового красителя по оси x и соответствующий канал флуоресценции по оси y, построенную в логарифмическом режиме. Загрузите образец, затем отрегулируйте напряжение детектора соответствующим образом и определите фракцию боковых ячеек популяции, которые выражают исследуемую поверхность. Затем запишите данные.

Здесь представлены репрезентативные результаты популяционного анализа побочных популяций, проведенного в клетках рака яичников человека. Боковая популяция, выделенная по анализу синего и красно-фиолетового излучения, была выделена в левом нижнем квадранте точечной диаграммы и составила 0,70% от всей анализируемой популяции. Более позднее применение ингибиторов оттока привело к исчезновению сигнала цветения, наблюдаемого для ранее идентифицированных клеток, подтверждая их побочный популяционный фенотип.

Наконец, клетки яичников человека также были охарактеризованы с точки зрения экспрессии ABCG2. ABCG2-положительное окрашивание наблюдалось в 0,67% клеток, соответствующих идентифицированной популяции сторон. После освоения этой процедуры ее можно выполнить примерно за два-три часа, если она выполнена правильно.

При проведении этой процедуры важно помнить, что фенотип побочной популяции строго зависит от оптимального соотношения концентрации красителя к плотности клеток. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить гидратацию обеих переменных до начала эксперимента. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как профилирование экспрессии генов, для дальнейшей характеристики побочных популяционных клеток, а следовательно, для идентификации новых мишеней, специфичных для раковых стволовых клеток, для будущей разработки лекарств.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии стволовых клеток к изучению характеристик тканевых стволовых клеток и раковых стволовых клеток, как у мышей, так и у мужчин. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как проводить СА с фиолетовым красителем, вызванным боковой популяцией, и как обнаружить предполагаемые раковые стволовые клетки в биологических образцах в вашей собственной лаборатории. Не забывайте, что работа с биологическими образцами может быть чрезвычайно опасной и что при работе с этой процедурой следует соблюдать такие меры предосторожности, как использование СИЗ и шкафов биологической безопасности.