Использование фенотипированного бокового популяционного фенотипа ДНК для обнаружения и очистки раковых стволовых клеток от биологических образцов

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении предполагаемых популяций раковых стволовых клеток в биологических образцах на основе способности клеток боковой популяции выводить краситель. Этот метод решает ключевой вопрос исследований раковых стволовых клеток, касающийся надежных способов обнаружения и очистки раковых стволовых клеток из биологических образцов. Основным преимуществом данной методики является использование функциональных маркеров, что обеспечивает более высокое разрешение.

Кроме того, экспрессия этих ABC-транспортеров лекарственных средств высококонсервативна среди раковых стволовых клеток, поэтому данный метод можно применять для многих различных видов рака. Применение этого метода способствует поиску терапевтических средств против раковых стволовых клеток, поскольку он облегчает последующий анализ, такой как профилирование экспрессии генов и валидация мишеней в высокоочищенных раковых клетках. Таким образом, данный метод позволяет получить представление о характеристиках раковых стволовых клеток.

Данный метод также можно использовать для характеристики систем, содержащих популяции, экспрессирующие ABC-транспортеры лекарственных средств, например, костного мозга. Процедуру продемонстрирует Элизабет Хофлехнер, техник моей лаборатории. Для начала культивируйте выбранную линию раковых клеток человека при 37 °C в 10–30 мл среды RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 2 мM L-глутамина и антибиотиков.

Когда клетки достигнут примерно 70–90% конфлюэнтности, удалите среду и добавьте два миллилитра 0,05% трипсина-ЭДТА, чтобы отделить клетки от поверхности чашки для культивирования. Затем промойте клетки 10 миллилитрами культуральной среды, перенесите суспензию в чистую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 250 ×g при температуре 4 °C в течение пяти минут. После осаждения клеток удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре культуральной среды.

Смешайте небольшую аликвоту клеточной суспензии с раствором трипанового синего и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Для подготовки тестовых образцов суспендируйте клетки в свежей культуральной среде, чтобы получить клеточную суспензию с концентрацией 1 × 10⁶ клеток/мл. После корректировки плотности клеток перенесите 3 мл образца в пробирку с круглым дном объемом 15 мл с пометкой «тест».

Затем добавьте в образец 10 µM фиолетового красителя и осторожно перемешайте суспензию на вортексе. Далее подготовьте контроли ингибирования, перенеся по 500 µL суспензии клеток с красителем в две пробирки для проточной цитометрии, помеченные как «контроль». В первую пробирку добавьте 50 µM Верапамила.

Добавьте 20 micromolar Fumitremorgin C во вторую пробирку. Перемешайте растворы путем осторожного пипетирования. Закройте все пробирки крышками и инкубируйте их при 37 °C в темноте в течение 90 минут.

Осторожно перемешивайте образцы каждые 15 минут. По завершении окрашивания промойте контрольные образцы ингибирования в 3–4 мл ледяного PBS. Подготовьте аликвоты исследуемого образца для последующего совместного окрашивания антителами.

Также промойте эти аликвоты и профильтруйте все образцы через сита с размером пор 70 micron, чтобы удалить возможные клеточные агрегаты. Затем центрифугируйте суспензии при 250 ×g при температуре four degrees celsius в течение five minutes. После ресуспендирования полученного осадка в 100 µL PBS храните клетки на льду в защищенном от света месте.

Затем добавьте к клеткам, предварительно окрашенным фиолетовым красителем, соответствующий набор антител, конъюгированных с флуорохромами. Перемешайте суспензии на вортексе и инкубируйте их при температуре 4 °C в темноте от 20 до 30 минут. После инкубации промойте клетки в 3–4 мл ледяного PBS, при необходимости профильтруйте образец.

Затем центрифугируйте при 250 ×g при 4 °C в течение пяти минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в 100 µL PBS. В завершение добавьте 7-AAD к клеткам, предварительно окрашенным фиолетовым красителем.

Инкубируйте образцы в темноте от 5 до 10 минут. Для анализа клеток с помощью проточного цитометра выделите соответствующую популяцию клеток на диаграмме рассеяния FSC SSC. Затем, используя различные сигналы FSC, исключите из выбранной популяции все клеточные агрегаты.

Исключите клетки с положительным окрашиванием 7-AAD, чтобы выделить популяцию жизнеспособных клеток. Для создания точечного графика эмиссии синего и красного красителей отобразите синий флуоресцентный канал по оси y, а красный флуоресцентный канал — по оси x. Переключите оба канала в линейный режим и соответствующим образом отрегулируйте напряжение детектора так, чтобы боковая популяция находилась в нижней левой части графика.

Затем выделите гейтом боковую популяцию (side population). Остановите сбор данных. После этого загрузите контроли ингибирования и проведите сбор данных.

Наконец, создайте точечный график, где по оси x будет отображаться красная флуоресценция фиолетового красителя, а по оси y — соответствующий канал флуоресценции в логарифмическом режиме. Загрузите образец, затем соответствующим образом отрегулируйте напряжение на детекторах и определите долю клеток боковой популяции, экспрессирующих исследуемый поверхностный маркер. После этого запишите данные.

Здесь представлены репрезентативные результаты анализа боковой популяции (side population), проведенного на клетках рака яичников человека. Боковая популяция, выделенная по синему и красно-фиолетовому эмиссионным сигналам, была определена в левом нижнем квадранте точечного графика и составила 0,70% от всей проанализированной популяции. Последующее использование ингибиторов эффлюкса привело к исчезновению сигнала флуоресценции, наблюдавшегося для ранее идентифицированных клеток, что подтвердило их фенотип боковой популяции.

Наконец, была проведена характеристика экспрессии ABCG2 в клетках яичника человека. Положительное окрашивание на ABCG2 наблюдалось в 0,67% клеток, что соответствует выявленной боковой популяции. После освоения данной методики процедура может быть выполнена примерно за два-три часа при условии правильного проведения.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что фенотип боковой популяции строго зависит от оптимального соотношения концентрации красителя к плотности клеток. Поэтому перед началом эксперимента настоятельно рекомендуется провести титрование обеих переменных. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как профилирование экспрессии генов, для дальнейшей характеристики клеток боковой популяции и последующего поиска новых специфических мишеней в раковых стволовых клетках для разработки лекарственных препаратов в будущем.

После своей разработки этот метод открыл исследователям в области биологии стволовых клеток возможность изучать характеристики тканевых стволовых клеток и стволовых раковых клеток как у мышей, так и у людей. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как проводить анализ боковой популяции (SA) с использованием красителя фиолетового цвета, а также о том, как выявлять предполагаемые стволовые раковые клетки в биологических образцах в вашей собственной лаборатории. Не забывайте, что работа с биологическими образцами может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование СИЗ и боксов биологической безопасности.