Протеин-тРНК-агароз-гель-запаздывающие анализы для анализа N 6 -threonylcarbamoyladenosine TcdA Функция

Общая цель этой процедуры заключается в демонстрации анализа замедления геля РНК, предназначенного для обнаружения и характеристики РНК-связывающих белков. Применение этого анализа используется для исследования взаимодействия между TcdA и транспортной РНК. Метод замедления в агарозном геле может дать ответы на ключевые вопросы в области биологии РНК.

Например, взаимодействует ли определенный белок с РНК, является ли это взаимодействие специфичным для последовательностей и сила взаимодействия. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он использует различные небольшие количества образцов белка и РНК и позволяет довольно быстро получить очень информативные результаты о взаимодействиях белка и РНК. Хотя этот метод может дать представление о комплексах белок-тРНК, он также может быть применен ко многим другим системам, таким как рибосомная РНК, матричная РНК и любые другие виды молекул РНК.

Утром извлеките флакон с замороженной кишечной палочкой BL21 DE3, преобразованным с помощью вектора экспрессии pET-23D EC triple-U. Приготовьте бульон лурии с низким содержанием соли или тарелку LB с добавлением 100 микрограммов на миллилитр ампициллина. Переверните тарелку и поместите ее в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, пока ближе к вечеру не появятся колонии.

Инокулируйте одну хорошо выросшую отдельную колонию в пять миллилитров LB плюс 100 микрограммов на миллилитр ампициллина и выращивайте в течение ночи. На следующее утро гранулируйте ячейки. После центрифугирования замените среду пятью миллилитрами свежего LB плюс 100 микрограммами на миллилитр ампициллина и повторно суспензируйте.

Используйте эту суспензию для инокуляции 200 миллилитров LB плюс 100 микрограмм на миллилитр ампициллина. Выращивайте клетки в течение пяти часов при 220 об/мин и 37 градусах Цельсия. Когда оптическая плотность культуры на 590 нанометрах достигает от 0,6 до 0,8, atdd1 миллимолярный IPTG к культуре запускает экспрессию гена тРНК triple-U.

После инкубации клеток при 37 градусах Цельсия в течение трех часов соберите клетки, центрифугируя культуру при 6500 g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы выполнить лизис, сначала повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах буфера для лизиса. Добавьте один объем кислотного фенола в повторно суспензированную клеточную гранулу в вытяжном шкафу и перемешивайте в течение одной минуты путем инверсии для лизирования клеток.

Затем центрифугируйте при 10 тысячах g в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Соберите верхнюю водную фазу, содержащую растворимую тРНК triple-U, с помощью пипетки. Следите за тем, чтобы не вызвать аспирацию органической нижней фазы.

Осаждение тРНК путем тщательного смешивания растворимой фазы с 2,5 объемами этанола 100% объема на объем путем инверсии в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Затем центрифугируйте при 15 тысячах g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно сцедите надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте богатую тРНК гранулу в четырех миллилитрах фильтрующего буфера для геля.

Следуя стандартной хроматографической практике, загрузите ресуспендированную тРНК triple-U в фильтрационную колонку с препаративным гелем высокого разрешения, предварительно уравновешенную в буфере для фильтрации геля. Установите скорость потока на 1 миллилитр в минуту для элюирования образцов. Чтобы начать подготовку образца, пипетируйте соответствующее количество TcdA, указанное в текстовом протоколе, в правильно маркированные центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте концентрацию 1,6 миллимоляра TCEP и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Закройте крышкой и выдержите смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. После инкубации добавьте аденозинтрифосфат и хлорид магния.

Перемешайте пипеткой перед инкубацией смеси в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее добавьте очищенную тРНК triple-U согласно текстовому протоколу и перемешайте образец с помощью пипетки. После инкубации образца при комнатной температуре в течение пяти минут добавьте фосфатно-солевой буфер до 100 микролитров конечного объема.

Тщательно перемешайте и добавьте глицерин до конечной концентрации 10%Vortex в образец, прежде чем кратковременно раскрутить содержимое пробирки. Приготовьте агарозный гель так, как описано в текстовом протоколе. Поместите блок электрофореза в лоток, наполненный колотым льдом, чтобы поддерживать температуру в камере на уровне четырех градусов Цельсия во время проведения электрофореза.

Осторожно нанесите пипеткой пять микролитров каждого образца в соответствующую лунку. Также добавьте подходящий маркер размера ДНК. Затем вставьте электроды в соответствующие слоты блока питания.

После включения блока питания установите напряжение на 100 вольт и запустите гель в течение 90 минут. Затем приготовьте раствор для окрашивания, смешав 50 миллилитров КЭ с 1Х подходящего красителя ДНК. После 90 минут электрофореза осторожно достаньте гель из лотка и поместите его в емкость с раствором для окрашивания.

Поставьте контейнер на коромысло на низкой скорости качания и покачивайте при комнатной температуре в течение 30 минут. Достаньте агарозный гель из емкости для окрашивания и осторожно постучите им по листу целлюлозной бумаги, чтобы удалить лишнюю жидкость. Затем поместите гель непосредственно на трансиллюминатор.

Включите ультрафиолетовый свет, чтобы визуализировать полосы, содержащие тРНК. Наконец, сфотографируйте гель. Здесь представлены репрезентативные результаты очистки тРНК для анализов замедления геля.

На хроматограмме фиксируется поглощение фракций элюирования при 254 нанометрах. Пул тРНК, обогащенный сверхэкспрессируемой тРНК triple-U, элуируется на самом высоком пике. Качество и количество пула тРНК исследуют с помощью электрофореза в агарозном геле.

Анализ замедления геля РНК показывает, что TcdA образует стабильный комплекс с тРНК triple-U в зависимости от концентрации тРНК, что приводит к образованию полосы белок-тРНК, которая мигрирует медленнее, чем свободная тРНК в передней части геля. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за два часа. При использовании этого протокола важно помнить о следовании строгим лабораторным методам для обеспечения химической стабильности тРНК.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать анализ замедления агарозного геля для исследования взаимодействия выбранного вами белка с тРНК, как в случае TcdA или с любым другим типом РНК.