В пробирке Рост Preantral фолликулов мыши под искусственной микрогравитации
17 декабря 2017 г.
Весьма перспективным технику для создания ткани конструкции без использования матрицы в культуре клеток в состоянии искусственной микрогравитации. С помощью системы ротационные культуры, мы рассмотрели, яичников фолликул и яйцеклетка созревания фолликула выживания, морфология, роста и яйцеклетки функции в условиях имитируемой микрогравитации.
Рост преантральных фолликулов мыши in vitro в условиях симулированной микрогравитации. Всю процедуру можно разделить на четыре части. В первой части фолликулы механически изолируют из яичников с помощью игл под стереомикроскопом.
Часть вторая: инкапсулируйте отдельный фолликул, перенося его пипеткой в центр каждой альгинатной микросферы. Часть третья: перенесите альгинатные микросферы, содержащие одиночные фолликулы, в каплю культуральной среды в системе ротирующего культивирования, которая создает условия симулированной микрогравитации. Часть четвертая: извлеките альгинатные микросферы и декапсулируйте фолликулы, инкубируя их в среде с добавлением альгинатлиазы в течение 30 минут при 37 °C.
Изоляция и инкапсуляция фолликулов. Соберите яичники в транспортную среду, затем поместите их в соответствующую лунку планшета. Под стереомикроскопом изолируйте фолликулы из яичников с помощью двух игл.
Следите за тем, чтобы не повредить вазомембрану. Подготовьте чашку с каплями среды и покройте ее маслом. Перенесите фолликулы в подготовленную чашку.
Промойте фолликулы в новой среде, затем перенесите их в капли среды. В одной капле среды должен находиться один фолликул. Подготовьте центрированную чашку для культивирования и добавьте раствор для инкапсуляции во внешний круг.
Подготовьте флакон с 0,8% раствором альгината. Добавьте 0,5 µL раствора альгината в центр чашки. Добавляйте капли раствора альгината в раствор для инкапсуляции по внешнему кругу чашки.
Перенесите фолликул в раствор альгината в центре чашки. Промойте фолликулы раствором альгината. Переместите фолликулы в середину каждой альгинатной бусины, проходя через мягкую поверхность раствора.
Каждая альгинатная бусина содержит один фолликул. Промойте альгинатные бусины раствором для инкапсуляции, чтобы они затвердели. Перенесите альгинатные бусины в новую чашку с поддерживающей средой.
Культивирование инкапсулированных фолликулов in vitro в условиях симулированной микрогравитации. Для контрольной группы добавьте 150 миллилитров культуральной среды в новую чашку и накройте ее слоем масла. Перенесите три альгинатных микросферы в каплю среды.
Инкубируйте чашку в инкубаторе с CO₂ для культивирования. Для имитации условий микрогравитации подготовьте чашку с маслом, снимите колпачок порта и залейте масло в сосуд через открытый порт, пока сосуд не заполнится почти полностью. Добавьте в масло 50 ml культуральной среды.
Перенесите три альгинатных гранулы в каплю среды. Установите на место крышку открытого порта. Необходимо удалить пузырьки воздуха из сосуда.
Снимите колпачок порта для шприца. Установите два шприца с маслом в порт для шприца. Переместите пузырьки воздуха из-под порта для шприца.
Втяните пузырьки воздуха в шприц и введите такой же объем масла из другого шприца. Убедитесь, что в сосуде нет пузырьков воздуха. Закройте клапаны, извлеките шприцы и установите на место колпачок порта для шприца.
Мы уже подготовили четыре сосуда с альгинатными гранулами. Теперь необходимо закрепить сосуды в вращающемся основании. Отрегулируйте скорость вращения до тех пор, пока капля среды не примет сбалансированное состояние.
Перенесите оба сосуда и основание в инкубатор с CO₂ для культивирования. Смена культуральной среды. Снимите крышку открытого порта, соберите альгинатные бусины и масло в новую чашку.
Найдите и перенесите альгинатные гранулы в чашку со средой для манипуляций. Восстановите систему культивирования в сосуде, как было сделано ранее. Извлечение фолликулов.
Снимите колпачок с открытого порта, соберите альгинатные бусины и масло в новую чашку. Извлеките альгинатные бусины и декопсулированные фолликулы из альгинатных бусин путем инкубации в перемещающей среде с добавлением альгинатлиазы в течение 30 минут при 37 °C. Результаты. Анализ жизнеспособности клеток показал, что в одиночных фолликулах, культивируемых в условиях нормальной гравитации, содержится больше живых и меньше мертвых клеток, чем в фолликулах, культивируемых в условиях симулированной микрогравитации.
Размер фолликула значительно увеличился при обоих режимах гравитации. Заключение. Наш метод предоставляет модель для изучения механизмов, участвующих в процессах развития ооцитов и клеток гранулезы in vitro в условиях моделируемой микрогравитации.
Обзор
В данном исследовании описывается протокол культивирования преантральных фолликулов мыши в условиях симулированной микрогравитации с использованием системы ротационного культивирования. Подход включает выделение и инкапсуляцию фолликулов в альгинатные бусины, их культивирование как в нормальных условиях, так и в условиях симулированной микрогравитации, а также оценку выживаемости и роста фолликулов и ультраструктуры ооцитов. Полученные результаты подчеркивают влияние микрогравитации на жизнеспособность фолликулов и развитие ооцитов, предоставляя модель для дальнейшего изучения фолликулогенеза in vitro в условиях измененной гравитации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Репродуктивная биология
- Биология развития
- Тканевая инженерия
Теоретическое обоснование
- Условия микрогравитации могут влиять на развитие клеток и тканей.
- Культивирование фолликулов in vitro является ценным инструментом для изучения развития ооцитов и клеток гранулезы.
- Системы симуляции микрогравитации позволяют исследовать роль гравитации в фолликулогенезе.
- Инкапсуляция в альгинат обеспечивает возможность трехмерного культивирования фолликулов.
Цель исследования
- Разработать протокол культивирования преантральных фолликулов мыши в условиях симулированной микрогравитации.
- Сравнить выживаемость и развитие фолликулов в условиях нормальной гравитации и симулированной микрогравитации.
- Оценить влияние микрогравитации на развитие ооцитов и клеток гранулёзы.
Используемые методы
- Механическое выделение преантральных фолликулов из яичников 14-дневных мышей с помощью игл под стереомикроскопом.
- Инкапсуляция одиночных фолликулов в 0,8% альгинатных гранулах.
- Культивирование инкапсулированных фолликулов в системе вращающегося сосуда для имитации микрогравитации с параллельными контрольными культурами при нормальной гравитации.
- Извлечение и декапсуляция фолликулов с использованием альгинат-лиазы.
- Оценка выживаемости фолликулов, измерение диаметров фолликулов и ооцитов, а также ультраструктурный анализ ооцитов.
Основные результаты
- Фолликулы, культивируемые в условиях нормальной гравитации, продемонстрировали более высокую жизнеспособность клеток по сравнению с фолликулами в условиях симулированной микрогравитации.
- Размер фолликулов значительно увеличился при обоих режимах гравитации.
- Симулированная микрогравитация привела к снижению выживаемости фолликулов и подавлению экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) и фактора дифференцировки роста 9 (GDF9).
- Ооциты из группы микрогравитации имели ультраструктурные аномалии.
Выводы
- Описанный метод позволяет изучать развитие фолликулов и ооцитов in vitro в условиях моделируемой микрогравитации.
- Моделируемая микрогравитация отрицательно влияет на выживаемость фолликулов и качество ооцитов.
- Для более точного моделирования фолликулогенеза in vitro в условиях измененной гравитации необходима дальнейшая оптимизация системы культивирования.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Культивирование преантральных фолликулов мыши в условиях симулированной микрогравитации представляет собой контролируемую систему для изучения механического влияния измененных физических сил на ранний фолликулогенез. Данная модель позволяет проводить количественную оценку выживаемости фолликулов, роста ооцитов и молекулярных маркеров, что повышает прогностическую достоверность исследований в области биологии развития. Этот подход позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения для трансляционных исследований в рамках разработки методов репродуктивной и тканевой инженерии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет снизить механистические риски при изучении развития фолликула и ооцита в условиях измененной гравитации.
- Обеспечивает функциональную валидацию таких молекулярных маркеров, как PCNA и GDF9, при созревании гранулезы и ооцита.
- Предоставляет количественную платформу для проверки гипотез в области репродуктивной биологии и тканевой инженерии.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать воспроизводимую систему 3D-культивирования для оценки жизнеспособности фолликулов и показателей их роста.
- Способствует стандартизации количественных показателей, включая диаметры фолликулов и ооцитов.
- Обеспечивает возможность сравнительного анализа выживаемости и молекулярной экспрессии при различных физических условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Предлагает модель для изучения значимых для патологии механизмов, влияющих на качество ооцитов и выживаемость фолликулов.
- Способствует сопоставлению результатов исследований in vitro с разработкой трансляционных биомаркеров в области репродуктивного здоровья.
- Обосновывает доклинические стратегии по оптимизации систем культивирования тканей в нестандартных условиях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая возможность проведения механистических исследований на ранних стадиях и разработку количественных методов анализа для репродуктивной биологии и тканевой инженерии.
- Открывающая биология: обеспечивает возможность проверки гипотез о влиянии гравитации на фолликулогенез и созревание ооцитов.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные количественные данные о жизнеспособности и росте в контролируемых условиях.
- Аналитика: обеспечивает получение измеримых конечных точек, таких как показатели выживаемости, экспрессия молекулярных маркеров и ультраструктурный анализ.
- Трансляционные исследования: позволяют перенести результаты исследований in vitro на доклинические модели для репродуктивной и регенеративной медицины.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для изучения механизмов в различных типах тканей и клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность моделей в биологии развития и репродукции.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации и воспроизводимости рабочих процессов 3D-культивирования и количественной оценки.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшего развития программ в области тканевой инженерии и репродуктивного здоровья.
- Влияние на портфель проектов: Обеспечивает приоритизацию механистических и трансляционных исследовательских инициатив с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области изоляции фолликулов, инкапсуляции и методов 3D-культивирования.
- Необходим доступ к специализированным системам ротационного культивирования и аналитической инфраструктуре для количественной оценки.
- Требуется межкомандная стандартизация тестов на жизнеспособность и анализа молекулярных маркеров.
- В зависимости от целей исследования может потребоваться адаптация для различных типов тканей или видов.
- Оптимизация параметров симуляции микрогравитации имеет решающее значение для достоверности и воспроизводимости модели.
