Мышцы на основе сердечной мышцы и самостабилизирующий биоробот - часть 2

Общая цель данного исследования заключается в заселении микрофабрикованных устройств клетками сердечной мышцы и характеристике биохимических и биомеханических свойств клеток на этих устройствах, а также их функционирования с течением времени. Описанный здесь подход может быть легко модифицирован для других экспериментов, требующих внесения клеток высокой плотности на микрофабрикованные устройства. Основным преимуществом биоактуатора, разработанного в данном видео, является то, что его можно легко адаптировать для количественного определения сил сокращения любого другого типа клеток.

Этот метод также может быть использован для изучения изменений биомеханических характеристик стволовых клеток в процессе их дифференцировки. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как этапы посева клеток трудно освоить только по текстовым описаниям. Эти действия должны быть выполнены правильно, чтобы обеспечить конфлюэнтное прикрепление клеток к плечам консоли, что необходимо для обеспечения надлежащей биологической функции.

Процедуру продемонстрирует Нираджа Нагараджан из моей лаборатории. Используя биоробота, начните работу с колбой T25. Для фиксации робота в нижней части колбы используйте магнит.

Магнит не требуется для биологических актуаторов, так как они не будут перемещаться из-за веса стеклянного шарика в основании. Сверните небольшой квадратный пластиковый лист, чтобы использовать его в качестве воронки, и поместите стерильную воронку над актуаторами в биороботах. Отрегулируйте диаметр широкого конца так, чтобы он соответствовал устройству, и высоту таким образом, чтобы воронка плотно прилегала при затягивании верхней части колбы.

Используйте отдельную колбу, чтобы проверить и отрегулировать плотность прилегания воронки. Плотное прилегание воронки гарантирует отсутствие утечки клеток в остальную часть среды, о чем упоминалось ранее. Это необходимо для обеспечения сплошного покрытия консольного плеча.

Установив воронку, ресуспендируйте кардиомиоциты в полной среде DMEM до плотности 16 миллионов клеток на миллилитр и медленно внесите по 400 µL суспензии в каждое устройство через воронки. Затем осторожно переместите флаконы обратно в инкубатор, стараясь не задеть устройства и установленные в них воронки. Оставьте клетки для адгезии на 24 часа при 37 °C.

По окончании периода инкубации медленно извлеките воронку. Осторожно промойте образцы PBS и снова наполните каждую колбу 10 миллилитрами свежей среды DMEM complete. Затем уберите магнит из биоробота, чтобы образцы находились во взвешенном состоянии, и поместите колбы обратно в инкубатор.

Установите в инкубатор камеру, оснащенную зум-объективом, для визуализации устройств в культуре. Затем добавьте светодиодную ленту в качестве источника света. После этого подключите камеру к компьютеру и откройте программу для получения изображений.

После запуска программы нажмите на изображение камеры во вкладке File, чтобы открыть все параметры камеры, и выберите подключенную камеру. Из списка вкладок выберите Live и вручную сфокусируйте изображение, поворачивая кольцо объектива. Затем выберите обрезку интересующей области (crop of the region of interest) на верхней панели.

Затем вручную нарисуйте прямоугольник в кадре видео, охватывающий биологический актуатор и консольные рычаги, чтобы отметить область интереса. В случае с биороботами захватывайте весь экран, чтобы зафиксировать плавательные движения устройства. Далее выберите Camera Settings и установите частоту кадров, отрегулировав экспозицию и соотношение пикселей живого изображения.

Установите частоту кадров примерно на 30 кадров в секунду. Наконец, нажмите кнопку записи, чтобы начать запись видео. Откройте программное обеспечение для программирования, нажав на соответствующий значок.

После загрузки перейдите в меню File, выберите Open и откройте m-скрипт для проведения анализа изображений. Убедитесь, что записанные TIF-изображения и их AVI-версии находятся в той же папке, что и m-файл, затем нажмите Run для запуска скрипта. Нажмите Play, чтобы начать выполнение программы.

После запуска нажмите кнопку Open и выберите TIF- или AVI-файл для анализа. Затем нажмите кнопку base. Выберите точку крепления кантилевера к основанию в верхней части и нажмите Enter.

Это позволит установить квадратный маркер на изображении для каждого кадра, чтобы обозначить положение основания кантилевера. Затем нажмите кнопку масштабирования и вручную кликните по одному краю стеклянного шарика. Переместите указатель мыши на противоположную сторону стеклянного шарика и нажмите Enter.

Это позволит провести линию для измерения диаметра стеклянного шарика и соотнести диаметр с отображаемыми пикселями. Нажмите кнопку Analyze. Затем сделайте клик вдоль кантилевера на небольшом расстоянии от первого квадратного маркера, обозначающего основание кантилевера.

Продолжайте кликать вдоль консоли, включая ее кончик, и нажмите Enter по завершении. В каждой точке клика на консоли будет поставлен знак X. В конце проверьте, правильно ли наложенный круг повторяет профиль консоли.

Если всё верно, нажмите кнопку перехода к следующему кадру. Это переключит изображение на следующий кадр в TIF-файле. Повторите эту процедуру для всех кадров.

После обработки всех кадров нажмите кнопку Export. Сначала запустите программное обеспечение для анализа изображений и загрузите видеофайл с плавающим биороботом. Затем откройте программу для работы с электронными таблицами.

На видео с загруженным биороботом найдите эталон размера, например, стеклянный шарик. С помощью инструмента Straight (Прямая) проведите линию через стеклянный шарик. Затем нажмите Analyze (Анализ) и выберите Set Scale (Установить масштаб).

Установите значение в поле Known distance на 3,000 micrometers и нажмите OK. Выберите точку на устройстве, которая не смещается между кадрами, чтобы использовать ее в качестве маркера, и запишите координаты X и Y этой точки в таблицу. Вернитесь в окно программы для анализа изображений и нажмите клавишу правой стрелки, чтобы перейти к следующему кадру. Снова укажите на маркер и запишите новые координаты X и Y в таблицу.

Повторите этот процесс для всех кадров и используйте полученные данные для анализа движения биоробота, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Значения статического и динамического напряжения актуатора извлекали из поверхностного напряжения ежедневно. Статическое напряжение представляет собой сократительное напряжение, которое клетки создают на поверхности в состоянии покоя, а динамическое напряжение — это напряжение, создаваемое клетками при максимальном сокращении.

По мере созревания клеток в культуре с течением времени наблюдалось постепенное увеличение статических и динамических напряжений. На шестой день максимальная сила тяги клеток составила 50 millinewtons per meter, а максимальная сила сокращения — около 165 millinewtons per meter. Параллельно с изменением статических и динамических напряжений до шестого дня также возрастали показатели созревания кардиомиоцитов, их роста и распластывания, а также степень взаимосвязи между клетками.

На основании видеоанализа здесь представлено сравнение средней скорости плавания, частоты сокращений и расстояния, преодолеваемого за один гребок, для трех биороботов с различными профилями плавания. Несмотря на то, что вертикальные биороботы имеют самую низкую частоту сокращений, они продемонстрировали наибольшую скорость плавания и наибольшее пройденное расстояние. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как осуществлять посев клеток сердечной мышцы на микрофабрикованные устройства, которые могут функционировать в качестве биологических актуаторов и биороботов.

Процесс получения изображений и последующего анализа данных, описанный в данном видео, демонстрирует удобный способ характеристики поведения клеток, а также эффективности работы устройства. При выполнении этой процедуры важно помнить, что срок жизни кардиомиоцитов ограничен, и активность клеток достигает пика на шестой день, после чего она постепенно снижается.