Мышцы на основе сердечной мышцы и самостабилизирующий биоробот - часть 2

Общая цель данного исследования состоит в том, чтобы заселить микроустройства клетками сердечной мышцы и охарактеризовать биохимические и биомеханические свойства клеток на этих устройствах, а также их производительность с течением времени. Описанный здесь материал может быть легко модифицирован для других экспериментов, требующих добавления клеток высокой плотности на микроизготовленных устройствах. Основное преимущество биоактуатора, разработанного в этом видео, заключается в том, что его можно легко использовать для количественной оценки сил сокращения клеток любого другого типа клеток.

Он также может быть использован для изучения изменений биомеханических характеристик стволовых клеток по мере их дифференцировки. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы посева клеток трудно изучить с помощью описаний из текстов. Они должны быть выполнены правильно, чтобы обеспечить слияние клеток на консистентных плечах, что необходимо для правильной биологической функции.

Демонстрировать процедуру будет Нираджха Нагараджан из моей лаборатории. С биороботом начните работу в колбе T25. С помощью магнита удерживайте его на месте на дне колбы.

Магнит не нужен для биологических приводов, так как они не будут двигаться из-за веса стеклянной бусины в основании. Скатайте небольшой квадратный пластиковый лист для использования в качестве воронки и поместите стерильную воронку над приводами в биороботах. Отрегулируйте диаметр на более широком конце, чтобы он соответствовал устройству, и высоту, чтобы он плотно прилегал к верхней части колбы.

Используйте отдельную колбу для проверки и регулировки посадки воронки. Плотное прилегание воронки гарантирует, что не произойдет утечки ячеек, о которых говорилось, в остальные среды. Это необходимо для обеспечения конфлюирующего покрытия консольного рычага.

С помощью воронки ресуспендируйте кардиомиоциты в полном DMEM с плотностью 16 миллионов клеток на миллилитр и медленно капайте 400 микролитров суспензии на устройства через каждую воронку. Затем медленно переместите колбы обратно в инкубатор, не потревожив устройства или воронки внутри. Дайте элементам прикрепиться в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

После инкубационного периода медленно удалите воронку. Аккуратно промойте образцы PBS и наполните каждую колбу 10 миллилитрами свежего DMEM в комплекте. Затем снимите магнит с биоробота, чтобы он был на плаву, и поместите колбы обратно в инкубатор.

Установите в инкубатор камеру, оснащенную зум-объективом, чтобы визуализировать устройства в культуре. Затем добавьте светодиодную ленту для использования в качестве источника света. Далее подключите камеру к компьютеру и откройте программу обработки изображений.

Оказавшись в программе, нажмите на изображение камеры во вкладке «Файл», чтобы открыть все параметры камеры, и выберите подключенную камеру. В списке вкладок выберите «Трансляция» и вручную сфокусируйтесь на изображении, отрегулировав диск объектива. Далее выберите обрезку интересующего региона на верхней панели.

Затем вручную нарисуйте прямоугольник в видеокадре, заключающий в себе устройство биологического привода и консольные рычаги, чтобы отметить интересующую область. В случае с биороботами захват всего экрана для того, чтобы записать плавательное движение устройства. Затем выберите «Настройки камеры» и установите частоту кадров, регулируя экспозицию и соотношение пикселей живого изображения.

Установите частоту кадров примерно 30 кадров в секунду. Наконец, нажмите кнопку записи, чтобы начать запись видео. Откройте программу для программирования, нажав на иконку.

После загрузки нажмите «Файл», «Открыть» и выберите файл скрипта m для выполнения анализа изображений. Убедитесь, что записанные изображения TIF и их версии AVI находятся в той же папке, что и файл m, а затем нажмите кнопку Выполнить, чтобы запустить скрипт. Нажмите кнопку воспроизведения, чтобы запустить саму программу.

После запуска нажмите кнопку «Открыть» и найдите файл TIF или AVI, который будет проанализирован. Затем нажмите кнопку «База». Выберите точку, где консоль крепится к основанию вверху, и нажмите Enter.

Это поместит квадратный маркер на изображение для каждого кадра, чтобы обозначить расположение основания кантилевера. Затем нажмите кнопку масштаба, а затем вручную щелкните по одному краю стеклянной бусины. Подведите указатель мыши к противоположной стороне стеклянной бусины и нажмите клавишу Enter.

При этом будет проведена линия, которая измеряет диаметр стеклянной бусины и связывает диаметр с отображаемыми пикселями. Нажмите кнопку «Анализировать». Затем щелкните вдоль консоли на небольшом расстоянии от первого квадратного маркера, представляющего основание консоли.

Продолжайте щелкать по консоли, включая наконечник, и нажмите Enter, когда закончите. Это поставит крестик на каждую точку, нажатую на консоль. Наконец, проверьте, правильно ли наложенный круг обводит профиль кантилевера.

Если все верно, нажмите на кнопку следующего кадра. Это переключит вас на следующий кадр в файле TIF. Повторите этот процесс для всех кадров.

После того, как все кадры будут обработаны, нажмите на кнопку «Экспорт». Начните с открытия программного обеспечения для анализа изображений и загрузки видеофайла с биороботом для плавания. Затем откройте программное обеспечение для работы с электронными таблицами.

В загруженном видео о биороботе найдите эталонный размер, например стеклянную бусину. Инструментом «Прямо» нарисуйте линию поперек стеклянной бусины. Затем нажмите «Анализ» и выберите «Установить масштаб».

Установите поле Известное расстояние на 3 000 микрометров и нажмите OK. Выберите точку на устройстве, которая не колеблется между кадрами, которая будет действовать как маркер, и запишите координаты X и Y этой точки в таблицу. Вернитесь в окно программного обеспечения для анализа изображений и нажмите клавишу со стрелкой вправо, чтобы перейти к следующему кадру. Снова наведите указатель мыши на маркер и запишите новые координаты X и Y в таблицу.

Повторите этот процесс для всех кадров и используйте данные для анализа движений биоробота, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Статические и динамические напряжения привода извлекались из поверхностного напряжения каждый день. Статический стресс – это сократительное напряжение, которое клетки проявляют на поверхности в состоянии покоя, а динамическое напряжение – это стресс, создаваемый клетками при максимальном сжатии.

По мере созревания клеток в культуре наблюдалось постепенное увеличение статических и динамических напряжений с течением времени. Они продемонстрировали максимальную силу сцепления ячеек 50 миллиньютонов на метр и максимальную силу сжатия около 165 миллиньютонов на метр на шестой день. Параллельно со статическими и динамическими стрессами, маркеры созревания, роста и распространения кардиомиоцитов, а также взаимосвязи клеток также увеличиваются до шестого дня.

На основе анализа видео показано сравнение средней скорости плавания, частоты ударов и пройденного расстояния за один гребок для трех биороботов с разными профилями плавания. Несмотря на то, что вертикальные биороботы имеют наименьшую частоту ударов, они продемонстрировали самую высокую скорость плавания и пройденное расстояние. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как засевать клетки сердечной мышцы на микроустройствах, которые могут выступать в качестве биологических актуаторов и биороботов.

Процесс получения изображения и последующего анализа данных, описанный в этом видео, демонстрирует удобный способ определения характеристик поведения клетки, а также производительности устройства. При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что продолжительность жизни кардиомиоцитов ограничена, а активность клеток достигает пика на шестой день. После чего, со временем он уменьшается.