Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы

Целью данного биосенсорного исследования является сравнение способности четырех регулярно используемых биосенсорных платформ предоставлять качественные кинетические данные и дать представление о технических проблемах и соображениях в экспериментальных дизайнах для оценки высокоаффинных взаимодействий антител-антигенов. Данное исследование отвечает на ключевые вопросы в области разработки лекарств для выбора биосенсорных платформ и форматов анализов, которые позволяют получить наиболее надежные результаты при оценке кандидатов на терапевтические антитела. Основное преимущество данного исследования заключается в том, что оно обеспечивает прямое и всестороннее сравнение различных биосенсорных платформ с точки зрения согласованности, качества и операционной эффективности данных.

Видеодемонстрация четырех протоколов имеет решающее значение, так как она помогает новым пользователям с небольшим практическим опытом узнать, как проводить эксперименты на этих инструментах. Для измерения кинетики в Biacore T100 нажмите «Файл», «Открыть новый метод» и откройте файл метода. Просмотрите параметры в методе.

В разделе Типы циклов установите время контакта на 220 секунд для захвата 1 по пути потока 2, 110 секунд для захвата 2 по пути потока 3 и 55 секунд для захвата 3 по пути потока 4. Расход составляет 10 микролитров в минуту для всех циклов улавливания. Выберите Образец 1 и проверьте образец раствора в качестве переменной.

Затем установите время контакта на 600 секунд, а время диссоциации на 2, 700 секунд на пути потока 1, 2, 3, 4. Расход устанавливается на уровне 30 микролитров в минуту. Затем выберите «Регенерация 1», введите glycine HCl pH 1,5 в поле раствора и установите время контакта на 20 секунд на пути потока 1, 2, 3, 4.

В разделе «Переменные настройки» введите двукратные титрующие концентрации: от 100 до 6,25 наномоляров для цикла 1-3, от 50 наномоляров до 3,12 наномоляров для цикла 4-8 и от 5 наномоляров до 0,323 наномоляров для цикла 9-10. В разделе «Настройка прогона» выберите путь потока обнаружения 2-1, 3-1, 4-1, затем нажмите «Далее». Проверьте Prime перед запуском, а затем нажмите кнопку «Далее» еще раз.

Выберите Штатив для образцов и реагентов 1 и укажите местоположение для реагентов. Внесите реагенты в отдельные флаконы с образцами соответственно и вставьте штатив в прибор. Нажмите кнопку Eject Rack, чтобы открыть дверцу отсека лотка для образцов, а затем вставьте штатив для образцов в прибор.

Затем нажмите кнопку Пуск и введите имя эксперимента, которое будет сохранено для запуска выполнения. Для кинетических измерений в ProteOn XPR36 начните иммобилизацию, выбрав Протоколы, а затем Образцы. Определите EDC/Sulfo-NHS как активатор в лунках H1-H6, белок A/G как лиганд в G1-G6, этаноламин как деактиватор в F1-F6, глицин как регенератор в E1-E6, PBS-T-EDTA как бланк в D1-D6, образец моноклонального антитела X в качестве лиганда в C1-C6 и человеческий PCSK9 в качестве аналита в лунках B1-B6.

Выберите «Шаги», а затем дважды щелкните «Иммобилизация» в редакторе протоколов. Этапы включают три последовательные горизонтальные инъекции EDC/Sulfo-NHS, белка A/G и одного молярного этаноламина. Каждый впрыск должен иметь скорость потока 30 микролитров в минуту и время контакта 300 секунд.

Затем нажмите «Восстановить». Введите три 18-секундных импульса глицина со скоростью 100 микролитров в минуту как в горизонтальном, так и в вертикальном направлениях. Затем следует два 60-секундных импульса PBS-T-EDTA со скоростью 25 микролитров в минуту, также в обоих направлениях.

Затем нажмите Лиганд и введите моноклональное антитело 1, моноклональное антитело 2 в вертикальном направлении, используя скорость потока 25 микролитров в минуту и время контакта 160 секунд. После нажатия кнопки «Анализировать» введите пять концентраций человеческого PCSK9 в пустой буфер по шести горизонтальным каналам одновременно. Используйте 40 микролитров в минуту в течение 600 секунд времени ассоциации, а затем 2 700 секунд времени диссоциации.

Затем нажмите «Регенерировать» и введите два 18-секундных импульса глицина со скоростью 100 микролитров в минуту в горизонтальном и вертикальном направлениях. Затем подготовьте образцы и реагенты в одном 96-луночном планшете в соответствии с определенными положениями реагентов. Перенесите пластину на прибор, а затем перейдите на вкладку «Выполнить», выберите протокол и нажмите «Пуск».

Продемонстрирована параллельная инъекция с помощью шести игл при записи экспериментальных данных в реальном времени. Для кинетических измерений в Octet RED384 настройте экспериментальный метод, сначала нажав кнопку «Эксперимент», затем «Мастер нового эксперимента», «Эксперимент с новой кинетикой», а затем «Базовая кинетика» в программном обеспечении для сбора данных. Затем нажмите кнопку "Изменить пластины" и измените значение "96 лунок" на 384 скважины на пластине 1 и пластине 2.

Определите типы и положения образцов на пластине, как описано в текстовом протоколе. Перейдите к определению анализа, чтобы определить экспериментальную установку. Экспериментальная установка определяется как базовое время 30 секунд, время регенерации 30 секунд, время уравновешивания 18 секунд, время загрузки 200 секунд, время ассоциации 500 секунд и время диссоциации 1 800 секунд.

Скорость встряхивания установлена на 1 000 об/мин. Чтобы добавить шаги в список этапов анализа, сначала нажмите на шаг, а затем нажмите на лунки, расположенные либо в образце, либо в пластине с реагентом. Во-первых, введите в инструкции по регенерации равновесия, чтобы подготовить античеловеческие датчики захвата Fc тремя циклами 15-секундных погружений в глицин, чередующихся с 15-секундными провалами в 1XKB.

Затем введите инструкции по загрузке, чтобы захватить образцы моноклональных антител на датчики захвата Fc против человека в течение 200 секунд. Затем введите базовые инструкции, чтобы установить сигнал интерферометрии биослоя за 60 секунд до шага ассоциации. Введите шаг ассоциации, чтобы погрузить датчики в лунки, содержащие различные концентрации человеческого PCSK9 в течение 500-секундного периода ассоциации.

Введите этап диссоциации, чтобы погрузить датчики, связанные с PCSK9, в новые лунки 1XKB на период диссоциации 1 800 секунд. Наконец, на этапе регенерации погружают сенсоры, связанные с моноклональным антителом PCSK9, в лунки с глицином с двумя 18-секундными импульсами между каждым циклом связывания. Перейдите в раздел «Обзор экспериментов», проведите пальцем по шагам, затем нажмите зеленую кнопку «Открыть», чтобы открыть отсек для образцов.

Перенесите пластины с образцами в прибор. Перейдите в раздел «Запустить эксперименты», введите время задержки в 60 секунд и встряхните планшет с образцом во время ожидания. Установите температуру планшета на 25 градусов Цельсия, введите название запуска эксперимента, а затем нажмите Go.Live сбор данных отображается здесь.

Для многоцикловых кинетических измерений в IBIS-MX96 установите чип датчика в микроспоттер непрерывного действия. Откройте программное обеспечение CFM2.0, затем нажмите «Загрузить настройки» и «96 Amine Couple». Поместите две пластины с образцом и реагентом в принтер CFM.

Чтобы создать массив антител, нажмите «Выполнить», чтобы запустить принтер и доставить EDC/Sulfo-NHS в верхней половине пластины реагента к датчику с помощью 48 микроканалов и циклически перемещать их по поверхности датчика в течение пяти минут. Доставьте образцы моноклональных антител в верхней половине исходной пластины к датчику и циклически перемещайте их по активированным поверхностям в течение 10 минут. Затем доставьте иммобилизационный буфер из конической трубки объемом 50 миллилитров на поверхность антитела в течение пяти минут.

Вставьте напечатанный чип датчика в прибор. В управляющем программном обеспечении нажмите Файл, Открыть измерение, Существующее измерение и выберите файл метода. Перенесите напечатанный чип датчика в прибор.

В общем меню выберите G-System Prime в разделе Полный сценарий системы. Затем выберите G-Quench для дезактивации поверхностей моноклональных антител путем введения 150 микролитров одного молярного этаноламина. В поле Analysis Cycle (Цикл анализа) выберите A-AP Standard Run (Стандартный запуск A-AP) в разделе IBIS Scripts (Скрипты IBIS).

Установите 1,0 минуты для базового уровня, 10,0 минуты для ассоциации и 90 шагов для диссоциации со скоростью восемь микролитров в секунду. Внутри циклов вводите человеку PCSK9 по одной концентрации за раз, после пяти буферных инъекций. Регенерируйте поверхности моноклональных антител глицином между каждым циклом связывания.

Для антител, взаимодействующих с человеческим PCSK9, показаны записанные сенсорграммы связывания в наложениях кинетической модели, взаимодействующих с человеческим PCSK9 в четырех инструментах. Профили связывания антител при различных плотностях одинаковы во всех приборах. Несмотря на то, что константы скорости, связанные с каждым из антител, варьировались в зависимости от прибора, их ранговый порядок оставался в основном одинаковым.

Была исследована воспроизводимость и постоянство сродства в кинетических скоростях на нескольких поверхностях антител. Как показано здесь, сильная линейность наблюдалась для всех констант скорости, сгенерированных с использованием Biacore T100 и ProteOn XPR36. Тем не менее, константы скорости, генерируемые Octet RED384, были менее линейными из-за колебаний некоторых скоростей выключения.

Это могло быть вызвано испарением образца с течением времени в микропланшете. Константы скорости, генерируемые IBIS-MX96, также были менее линейными из-за колебаний поверхностных неоднородностей. Активность связывания антител, связанная с большинством систем, была стабильной, в то время как примерно в десять раз более низкая активность наблюдалась для метода с амино-сопряженным способом из IBIS-MX96.

Возможно, это было связано с инактивацией антител или генерацией ориентации антител, которые не проводили связывание с антигеном. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить эксперименты на каждой из четырех биосенсорных платформ и как выбрать подходящую биосенсорную технологию для ваших собственных исследовательских целей. Наше прямое сравнительное исследование показывает, что каждая биосенсорная платформа имеет свои преимущества и недостатки.

Несмотря на некоторые присущие приборам систематические ограничения, прямой порядок констант как ассоциации, так и скорости диссоциации сильно коррелировал между этими приборами. Для целей ранжирования кандидатов, предполагая, что количество образцов и количество материалов не являются ограничивающими факторами, может быть использован любой из этих инструментов, поскольку они могут сравнивать антитела, независимо от импортируемого инструмента. Существует компромисс между надежностью данных и пропускной способностью выборки.

Biacore T100, за которым следует ProteOn XPR36R, продемонстрировал наилучшее качество и согласованность данных. В то время как Octet RED384 и IBIS-MX96 демонстрируют высокую гибкость и пропускную способность при компромиссах в отношении точности и согласованности данных. Для исследований, требующих чувствительного и надежного обнаружения, лучше всего подходит Biacore T100 или ProteOn XPR36.

Для исследований, в которых скорость является критическим фактором и требуется большое количество образцов, предпочтительнее использовать Octet Red384 или IBIS-MX96. Приборы с непрерывным потоком жидкости X предоставляют высококачественные данные для разрешения взаимодействий с низкой скоростью диссоциации. Основным ограничением для прибора BRI fluid ex-a-fray является испарение образца с течением времени в микропланшете, что может привести к восходящему дрейфу, что ставит под угрозу точность данных.