Анализ промотора c-KIT-лиганда с использованием иммунопреципитации хроматина

Общей целью этой процедуры иммунопреципитации хроматина является оценка TGF-индуцированного бета-1 связывания транскрипционного фактора SMAD2 с SMAD-связывающими элементами в промоторе C-набора. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, такие как транскрипция генов, вызванная цитокинами. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обладает потенциалом для демонстрации прямого связывания факторов транскрипции и других регуляторных белков транскрипции с их сайтами связывания ДНК in vivo.

Вырастите клетки до конфлюенции от 70 до 80% на десятисантиметровых тканевых планшетах. Стимулируйте клетки в соответствии с экспериментальными целями. Удалите питательную среду из ткани, и добавьте пять миллилитров раствора для фиксации.

Затем инкубируйте клетки в течение 10 минут при комнатной температуре на встряхивающей платформе. Удалите раствор для фиксации, и дважды промойте клетки 10 миллилитрами ледяного одного X PBS. Удалите один X PBS и добавьте пять миллилитров раствора для остановки глицина.

После инкубации клеток в течение пяти минут при комнатной температуре на встряхивающей площадке удалите раствор остановки глицина и дважды промойте клетки 10 миллилитрами ледяного масла одним X PBS. После удаления PBS добавьте два миллилитра раствора для скребка и соберите клетки с помощью скребка. Затем переложите собранные клетки в коническую трубку на льду.

Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при температуре 600 °G и четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре одного буфера для лизиса Х-клеток и выиграйте на льду в течение 30 минут. После того, как гранула будет повторно суспендирована в буфере для лизиса клеток, перенесите клеточную суспензию в ледяной гомогенизатор Dounce и в течение 10 ударов используйте пестик типа B для разрушения клеток.

Затем перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте образец в течение 10 минут при температуре 2,400 раз G и четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 350 микролитрах буфера для разложения ядер. После инкубации образцов в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия добавьте микрококковую нуклеазу и перемешайте путем вортексирования.

Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-20 минут, перемешивая образцы каждые две минуты путем инверсии. Время в некоторой концентрации, если вы находитесь между клеточными линиями, может потребовать оптимизации в случае неоптимального ферментативного сдвига. Альтернативная процедура стрижки с использованием коммерчески доступного соникаре может быть найдена в текстовом протоколе.

После инкубации с микрококковой нуклеазой добавьте семь микролитров ледяной 0,5 молярной ЭДТА, чтобы остановить реакцию. Центрифугируйте образцы со срезанной ДНК в течение 10 минут при температуре 16, 200 G и четырех градусах Цельсия. Перенесите срезанную ДНК, содержащую надосадочную жидкость, в свежую микроцентрифужную пробирку.

Аликвота 50 микролитров в отдельную микроцентрифужную пробирку, для подтверждения успешного среза ДНК, как описано в текстовом протоколе. Оставшийся объем используйте сразу для иммунопреципитации или храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Смешайте от 10 до 25 микрограммов сшитого хроматина с 25 микролитрами магнитных гранул белка G иммунопреципитации хроматина.

Затем добавьте 10 микролитров буфера для разведения иммунопреципитации и один микролитр коктейля ингибиторов протеазы. После четырех часов инкубации добавьте от одного до 10 микрограммов антител в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. И добавить дистиллированную воду до конечного объема в 100 микролитров.

Инкубируйте образцы на сквозном вращателе в течение четырех-12 часов при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации поместите пробирки на магнитную подставку. Как только магнитные шарики агрегируются к боковой стороне трубки, осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость.

Промойте бусины три раза с 800 микролитрами буфера для промывки одного. Для каждой промывки перемешивайте бусины, переворачивая трубку несколько раз. Затем поместите трубку на магнитную подставку и осторожно снимите буфер для промывки, как только магнитные шарики соберутся на боковой стороне трубки.

Далее промойте бусины один раз 800 микролитрами буфера для стирки два, используя ту же процедуру. После промывки повторно суспендируйте шарики в 50 микролитрах элюирующего буфера и инкубируйте образцы на ротаторе «конец в конец» в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку с помощью магнитной подставки.

Добавьте шесть микролитров пяти моляров хлорида натрия для обратного сшивания, а затем два микролитра протеиназы К. После смешивания образцов инкубируйте их в течение двух часов при температуре 65 градусов Цельсия. На этом этапе образцы могут быть непосредственно проанализированы на наличие сайтов связывания с белками, как описано в текстовом протоколе, или могут храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для подтверждения TGF-бета-1-индуцированного связывания SMAD2 с промотором SCF был проведен иммунопреципитационный анализ хроматина.

Лечение TGF бета-1 привело к связыванию SMAD2 с промотором SCF в линиях рака печени человека, HepG2 и Hep3B. При отсутствии стимуляции TGF beta 1 связывание с SMAD не отмечалось. В качестве положительного контроля для индуцированной TGF бета-1 активации SMAD проводили иммунопреципитацию хроматина для PAI-1.

Промотор PAI-1 является известной мишенью TGF beta и SMAD. Специфичность иммунопреципитации SMAD2 была подтверждена использованием неспецифических антител IgG. Связывание SMAD2 с SBE не отмечалось после иммунопреципитации IgG.

Для подтверждения TGF Beta 1-индуцированного связывания STAT3 с геном бета-лиганда TGF были проведены иммунопреципитационные анализы хроматина с использованием обработанных TGF бета 1 клеток HepG2 и Hep3B. Лечение TGF beta 1 привело к связыванию STAT3 со вторым предполагаемым сайтом связывания STAT3 гена TGF beta, но не с первым. В данном примере положительное связывание STAT3 с STB-2 служит внутренним положительным контролем.

Как и в другом эксперименте по иммунопреципитации хроматина, связывание STAT3 с ST-2 не наблюдалось после иммунопреципитации с использованием IgG. После освоения эта техника может быть выполнена за один или два дня в зависимости от антител, если она выполнена правильно. При выполнении этой процедуры важно следовать рекомендациям лаборатории по технике безопасности и быть очень точным на каждом этапе протокола.

При выполнении этой процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как проверка паспорта безопасности и ношение защитного снаряжения, такого как перчатки, белый халат и защитные очки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать связывание белка с конкретными последовательностями связывания ДНК. В соответствии с этим протоколом могут быть выполнены другие методы, такие как промоторный анализ, чтобы подтвердить функциональную значимость связывания белковой ДНК, демонстрируемой иммунопреципитацией хроматина.