Метод проверки влияния экологических сигналов на поведение спаривания в Drosophila melanogaster

Общая цель этого поведенческого анализа состоит в том, чтобы количественно оценить влияние очередей окружающей среды на репродуктивное поведение, такое как ухаживание и спаривание. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области поведенческой биологии и еврогенетики. Например, вывод генетических факторов и факторов окружающей среды на репродуктивное поведение и механизмы, которые смягчают это поведение.

Этот метод обеспечивает скорость и гибкость при тестировании широкого спектра очередей окружающей среды, влияющих на размножение. И это с очень большим количеством повторов. Демонстрировать процедуру будет Дженке Гортер, аспирант из моей лаборатории.

Начните эксперимент с приготовления одного литра насыщенной муховой среды. Налейте один литр водопроводной воды в двухлитровый стеклянный стакан с магнитной мешалкой. И поставьте стакан на магнитную горячую плиту.

Не допускайте помешивания и увеличьте огонь до 300 градусов Цельсия, пока не будет достигнута температура кипения. Включите помешивание до 500 об/мин и добавьте ингредиенты в кипящую воду. Дождитесь, пока дрожжи энергично вспенятся.

Затем убавьте температуру конфорки до 120 градусов по Цельсию. Через 10 минут убавьте конфорку до 30 градусов Цельсия. И дайте смеси размешаться, пока она не остынет до 48 градусов по Цельсию.

Следите за температурой, вставляя термометр непосредственно в пищу. Растворите два грамма Тегосепта в 10 миллилитрах 96%-ного этанола. Соедините смесь и пять миллилитров одной молярной пропионовой кислоты в стакан

Помешивайте в течение трех минут. Нагрейте иглу до покраснения в горелке Бунзена. И проткните отверстие диаметром 0,3 сантиметра с верхней стороны пластиковой чашки Петри размером 3,5 сантиметра на 1,0 сантиметра.

При приготовлении пищевой среды, с пахучими составами, сначала пипеткой внесите в посуду 30 микролитров нужного соединения на 1/2 экспериментальной посуды. Остальную 1/2 посуду оставьте пустой для сравнения. С помощью пятимиллилитровой серологической пипетки насыпьте три миллилитра пищевой среды, покрывающей дно посуды.

Накройте его марлей, чтобы предотвратить загрязнение, и дайте среде застыть в течение одного часа при комнатной температуре. Далее накройте посуду крышкой и заклейте крышки скотчем с двух сторон. Подготовьте небольшие пробки из парафиновой пленки, чтобы закрыть отверстия посуды, раскатав кусочки парафиновой пленки в рулоны толщиной в ноль целых два сантиметра.

А затем нарезаем их на нулевые целые пять сантиметровых отрезков. Прорежьте два небольших отверстия в перегородке, чтобы плотно прилегать к колючей арматуре переборки. Подгоните открытые крышки от четырех десятых пяти сантиметров с септумом Silcone толщиной четыре целых три сантиметра.

Прикрепите маленькую трубку из ПВХ к обоим выходным отверстиям, выходящим из бутылки, и только к одному из входных отверстий, входящих в бутылку. Затем прикрепите стеклянную трубку к выходному отверстию каждой бутылки с культурой YPD с помощью небольшой трубки. Наполните трубку стекловолокном.

И автоклавируйте его перед использованием. Оберните установленные колпачки и трубки алюминиевой фольгой. И автоклавируйте их в течение 25 минут при температуре 120 градусов Цельсия и давлении в один бар.

Опустите стерильный наконечник для пипетки объемом 100 микролитров в одну из колоний дрожжей из агаровой пластины YPD и опустите его в бутылку с жидкой средой Autoclaved YPD. Укупорьте эту бутылку с дрожжами и жидкой средой YPD, а также бутылку для контроля среды YPD, без дрожжей, с автоклавными крышками, установленными в выпускном отверстии. Чтобы предотвратить загрязнение среды YPD микроорганизмами, прикрепите маленькую трубку к стерильному шприцевому фильтру нулевой целых четыре целых пять микрометров, с помощью пластикового нажатия на соединитель трубки переборки, идущий в сторону фильтра.

И винт на пластиковом коннекторе переборки, выходящий из фильтра. Затем прикрепите трубку к входному отверстию бутылки для культуры YPD. Поместите бутылки на отдельные магнитные пластины.

И размешайте раствор при 100 оборотах в минуту, при комнатной температуре, в течение 24 часов до начала эксперимента. Соедините входные отверстия обеих бутылок с трубкой, подключенной к сжатому воздуху. Обязательно подключите выходное отверстие экспериментальной бутылки для дрожжей к трубке, выпускающей запах дрожжей из экспериментальной комнаты, чтобы предотвратить вмешательство в эксперимент.

Прикрепите трубку из ПВХ к выходной стороне стеклянной трубки и подведите ее к нижним отверстиям экспериментальной коробки. С помощью Т-образного разветвителя с внешним диаметром больше или равным нулю пяти целых пяти сантиметров и короткими отрезками небольших трубок из ПВХ прикрепите две серологические пипетки к каждому из двух выпускных отверстий с обеих сторон. Примотайте пипетки скотчем на листе белой бумаги под камерами, в стальном ящике.

С помощью ротовой пипетки поместите одну подопытную самку в маленькую чашку Петри при температуре 6 часов ZT. И дайте мухе акклиматизироваться к брачной арене в течение одного часа. Через час, на седьмом ЗТ, перенесите самца дикого типа в чашку Петри.

И нажмите «Начать мониторинг» на 24 часа. Для эксперимента с воздушным насосом расположите чашку таким образом, чтобы выходное отверстие для пипетки было подключено к входному отверстию сопрягаемой арены. Чтобы проанализировать брачное поведение пары, выберите одну из открытых картинок в программе для просмотра изображений.

И перелистывайте их в хронологическом порядке. Запишите дату, номер эксперимента, номер чашки и время начала в таблицу в той же строке. Снимайте время начала каждой арены с момента ее размещения под камерой веб-камеры.

Запишите временную метку с картинок. Отметьте время начала каждого совокупления в той же строке, в таблице. Спаривание можно считать инцидентом, когда самец оседлал самку, а пара остается умеренно неподвижной и в одной и той же позе, по крайней мере, пять последовательных кадров.

Анализ дрожжевого воздуха, выделенного для пищевой среды, показывает, что брачная пара не реагирует на запахи дрожжей, когда в пищевой среде нет дрожжей. Но они увеличивают частоту спаривания в воздухе дрожжей, когда дрожжи также добавляются в пищевую среду. Женская восприимчивость увеличивается в присутствии уксусной кислоты.

Но только в том случае, если в среде присутствует пептон, что свидетельствует о том, что мухи должны одновременно ощущать аминокислоты и уксусную кислоту, чтобы увеличить частоту их спаривания. После освоения этой техники ее можно настроить за шесть часов. А поведенческий анализ можно провести за пять часов, если все сделать правильно.