Оценка гиппокампальной дендритной сложности у пожилых мышей с использованием метода Гольджи-Кокса

Общая цель этой методологии состоит в том, чтобы правильно окрашивать ткань мозга по методу Гольджи для изучения и количественной оценки морфологии и сложности дендритов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии. Поскольку окрашивание по методу Гольджи окрашивает только небольшое подмножество клеток, этот метод может быть использован для отслеживания структуры нейронов.

Главное преимущество этой методики заключается в том, что участки мозга можно легко окрашивать без риска их пересыхания или отпадения во время любого из этапов промывки. Демонстрировать процедуру будут Фред Киффер, Тайлер Александр и Джули Андерсон, аспиранты лаборатории доктора Аллена. Начните с погружения свежесобранных, незафиксированных половинок мозга грызунов в пять миллилитров или раствор на основе хлорида ртути.

Так как раствор хлорида ртути светочувствителен, накройте трубку фольгой. Храните образцы в темноте при комнатной температуре. На следующий день медленно сцедите раствор во временный контейнер, прежде чем правильно утилизировать его в контейнер для биологически опасных отходов.

Добавьте пять миллилитров свежего раствора хлорида ртути и следите за тем, чтобы мозги были погружены. Верните образцы в темноту при комнатной температуре еще на 13 дней. Через 14 дней приготовьте буфер после пропитки, добавив 30 грамм активного буфера после пропитки в 90 миллилитров дистиллированной или деионизированной воды, DH2O.

Заполните каждую лунку шестилуночного планшета 6,5 миллилитрами буфера после пропитки, по одной лунке на мозг. Затем удалите раствор хлорида ртути из тканей мозга, как и раньше. Промойте ткань DH2O, затем перенесите ткань в шестилуночные планшеты с буфером для последующей пропитки.

Накройте тарелки пленкой и храните при комнатной температуре в темноте. На следующий день аспирируйте и замените буфер после пропитки. Снова накройте тарелку крышкой и храните в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия.

Приготовьте две или три 12-луночные пластины для каждого мозга, сначала пометив пластины на крышках номерами в порядке возрастания слева направо и вверх вниз. Добавьте идентификационный номер разреза мозга. Внесите пипетку по два миллилитра 1X PBS в каждую лунку каждой пластины, затем установите столик и включите вибратом.

Затем наклейте скотч на тканевый блок держателя образца и добавьте сверху немного цианоакрилатного клея. Извлеките мозг из шестилуночной пластины и поместите его на пластиковую или стеклянную посуду. Используйте обоюдоострое лезвие из нержавеющей стали, чтобы разрезать мозжечок каудально, следя за тем, чтобы оставшаяся на мозге часть мозжечка была плоской.

Затем нанесите на клей плоскую поверхность оставшегося мозжечка. После того как клей высохнет, поместите держатель образца с салфеткой в ванну для образцов. Поместите ванну с образцом на вибратом и накройте образец ткани PBS.

Затем прикрепите лезвие к держателю лезвия вибратома и медленно опустите лезвие в ванну для образцов, пока оно полностью не погрузится и не окажется немного ниже верхней части ткани. Затем установите скорость вибратома на семь, амплитуду на шесть и угол реза на 12 градусов. Запустите вибрацию и разрежьте секции толщиной 200 микрон.

С помощью большой кисти переместите срезы ткани из ванны для образцов в каждую предназначенную лунку 12-луночных планшетов. Продолжайте резать ткань до тех пор, пока не будет достигнуто нужное количество участков ткани. После секции с помощью трансферной пипетки отсасывайте PBS из лунок 12-луночного планшета, затем добавьте два миллилитра PBS-T и промывайте в течение 30 минут с перемешиванием.

Ближе к концу периода промывки разбавьте три части раствора гидроксида аммония пятью частями DH2O. Затем, после снятия PBS-T, добавьте разведенный раствор гидроксида аммония. Защитите участки от света с помощью фольги и испачкайте в течение 19-21 минуты.

Затем, безопасно удалив раствор гидроксида аммония, добавьте буфер после окрашивания. Защитите пленкой и испачкайте еще от 19 до 21 минуты. Наконец, промойте секции в PBS-T три раза в течение пяти-10 минут каждый раз.

Закрепите секции на предметных стеклах с 1%-процентным желатиновым покрытием с помощью большой кисти. Дайте им высохнуть в течение 20-30 минут при комнатной температуре, затем поместите их в банку Coplin и оставьте на ночь. Снимите предметные стекла с банки Coplin и поместите их в пластиковую решетку в вытяжном шкафу.

Поместите в посуду для окрашивания, содержащую 100% этанол, на пять минут. Обезвожьте срезы еще двумя пятиминутными промывками этанолом. Затем поместите предметные стекла в стеклянную решетку и с помощью металлической ручки опустите решетку в стеклянную тарелку, содержащую 99% ксилола.

Промойте слайды в двух сменах ксилола по пять минут каждая. По истечении времени на вторую промывку снимайте предметные стекла с ксилола по одному и быстро покрывайте ткань примерно 0,25 миллилитрами монтажного материала. Далее возьмите крышку слайдера и наложите ее на носитель.

Протолкните все попавшие пузырьки воздуха под крышками слайдов к краю тупым предметом, например, концом кисти. Поместите предметные стекла в место, защищенное от прямых солнечных лучей, и дайте им высохнуть в течение двух-трех дней. После высыхания приступают к получению изображения с помощью микроскопа и анализу с помощью соответствующего программного обеспечения.

На этом ярком изображении показан нейрон, окрашенный по методу Гольджи, который соответствует критериям визуализации и дальнейшего анализа. Все три типа позвоночника можно легко увидеть. Окрашивание равномерно по всей длине дендрита, и дендрит изолирован от других нейронов.

Этот рисунок показывает, что окрашенные нейроны Гольджи в зубчатой извилине показали уменьшение длины на четвертом и шестом порядках после лечения 5-фторурацилом по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор. Окрашивание по Гольджи может быть использовано для выявления значительных различий в плотности позвоночника. В апикальных пирамидальных дендритах CA1 введение 5-фторурацила живым мышам значительно снижало плотность позвоночника.

В базальных дендритах существенных изменений общей плотности колючек не наблюдалось. Анализ Шолла апикальных пирамидальных дендритов CA1 показал, что лечение 5-фторурацилом значительно снижает арборизацию дендритов на расстоянии от 40 до 160 микрон от сомы. В базальных дендритах лечение 5-фторурацилом уменьшало арборизацию дендритов на расстоянии от 30 до 110 микрон от сомы.

После освоения эта техника, учитывающая как процесс окрашивания по методу Гольджи, так и монтаж, чистку и покрытие, может быть выполнена за три часа на мозг при правильном выполнении. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению нейроанатомических связей в мышиной модели. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что срезы должны находиться в растворе гидроксида аммония всего от 19 до 21 минуты, чтобы не перекрасить нейроны.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как правильно окрашивать, резать и полоскать ткани мозга. Не забывайте, что работа с раствором на основе хлорида ртути, раствором гидроксида аммония и ксилолом может быть крайне опасной, поэтому соблюдайте меры предосторожности и надевайте лабораторные перчатки и работайте в вытяжном шкафу при выполнении этой процедуры.