Перезапуск нейронных цепей: новый метод быстрого наращивания нейритов и функционального нейронного соединения

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы инициировать новые невриты, быстро удлинить их и точно соединить с клетками-мишенями. Эта процедура возможна только при использовании клеток, выращенных в контролируемой и воспроизводимой среде. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы нейронауки.

Что ограничивает скорость роста нейронов? Как быстро они могут расти? Играют ли роль механические подсказки?

Мы также можем изучить, как формируются синапсы, как нейроны находят клетку-мишень. Как стареют, созревают синапсы? И в-третьих, мы можем начать системно строить нейронные сети, изучать, как нейроны вычисляются.

Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он обеспечивает простоту манипуляций, экспериментальную воспроизводимость и, в конечном счете, высокую степень контроля на уровне отдельных клеток. Чтобы начать эту процедуру, очистите и подготовьте нужное количество стерильных покровных листков. Затем покройте каждый чехол 0,5-1 миллилитром 100 микрограмм на миллилитр PDL в течение не менее двух часов при комнатной температуре.

После этого промойте чехол дважды водой и удалите всю жидкость. Дайте им высохнуть в стерильном месте в течение 5-10 минут или пока поверхность полностью не высохнет. Затем поместите микрофлюидные устройства узорами вверх под ультрафиолетовый свет в шкаф биобезопасности на 10 минут.

Через 10 минут поместите микрофлюидное устройство узором вниз в контакт с чистым защитным стеклом. С помощью пинцета мягко надавите на устройство, чтобы оно прилипло к стеклу. Чтобы заполнить однопопуляционное устройство средой, добавьте 50 микролитров полной клеточной среды в правую верхнюю лунку.

А затем добавьте еще 50 микролитров готовой клеточной среды в диагональную к ней лунку. Чтобы заполнить многопопуляционное устройство средой, добавьте 30 микролитров полного НБМ в один ряд лунок. Следите за тем, чтобы среда протекала между лунками.

Затем добавьте по 50 микролитров среды в каждую из оставшихся лунок. Поместите устройства в большую тарелку с открытой чашкой с автоклавной водой и поместите чашку в инкубатор на один-два часа, пока готовится клеточная культура. Теперь удалите среду из верхних лунок микрофлюидных устройств, не опорожняя лунки.

Затем добавьте 20 микролитров концентрированного клеточного раствора в верхнюю правую лунку микрофлюидного устройства и проверьте в микроскоп, как клетки протекают внутри микрофлюидного устройства с одной популяцией. Чтобы пластинировать клетки в устройстве для множественных популяций, добавьте по 20 микролитров концентрированного клеточного раствора в каждую из верхних лунок. Под микроскопом проверьте, находятся ли клетки внутри камер.

После этого поместите устройства в инкубатор на 15-30 минут, чтобы способствовать прикреплению клеток к субстрату. После того как клетки прикрепятся к субстрату, добавьте 40 микролитров NBM в две верхние лунки устройства с одной популяцией. Это поможет удалить пузырьки воздуха из микроканалов.

Добавьте 20 микролитров MBM в верхние лунки устройства для множественных популяций, в те же лунки, куда были закачаны клетки. Среда должна немного выступать, чтобы сформировать положительный мениск, и придать лункам верхнюю сторону кекса. За один-два дня до демонтажа микрофлюидного устройства добавьте два миллилитра предварительно подогретого NBM в каждую чашку для образцов и залейте камеры.

Затем держите устройства в инкубаторе. Затем с помощью стерильного пинцета и наконечника для пипетки удалите микрофлюидные устройства из покровных стекол, оставляя узорчатую конфигурацию нейронов. При этом при этом от 40 до 60 микролитров готового PDL покрывают гранулы до клеточной культуры.

Затем верните образец в инкубатор на один час, чтобы способствовать образованию синаптических контактов. Затем установите образец в экспериментальную установку таким образом, чтобы клетки можно было оценить сверху с помощью двух микропипеток, а также получить оптический доступ. В этой конфигурации ПЗС-камера расположена на боковом порту микроскопа для захвата изображений.

Подсоедините каждую пипетку, наполненную физиологическим раствором, к одномиллилитровому шприцу, затем обдайте образец физиологическим раствором. Затем под микроскопом проверьте расстояние между двумя изолированными популяциями нейронов, чтобы убедиться, что эти две популяции не связаны естественным образом. Выберите бусину PDL, которая не прикреплена к нейрону в поле зрения.

Совместите бусину с наконечником микропипетки, сосредоточившись на бусине, а затем на микропипетке. Впоследствии поднесите кончик как можно ближе к бусине, наблюдая за ней через микроскоп. Затем приложите отрицательное давление к пипетке, чтобы захватить шарик, и поддерживайте отрицательное давление на протяжении всего эксперимента.

Теперь выберите шарик PDL, прикрепленный к нейрону в поле зрения, и прикрепите его ко второй микропипетке с помощью отсасывания. Потяните нейронный комплекс гранул PDL, медленно перемещая либо микроманипулятор, либо предметный столик образца со скоростью 0,5 микрометра в минуту на 1 микрометр, и сделайте паузу на пять минут, чтобы дать возможность инициации нейритов. Потяните нейронный комплекс гранул PDL, медленно перемещая его в сторону со скоростью 0,5 микрометра в минуту на два микрометра, затем сделайте паузу на пять минут, чтобы обеспечить удлинение нейритов.

После успешного начала и удлинения нейрита в течение первых пяти микрометров непрерывно вытягивайте нейрит со скоростью 20 микрометров в минуту. Чтобы соединить нейроны, выберите участок, богатый нейритами. С помощью других шариков измерьте высоту наконечника пипетки над защитным стеклом и опустите комплекс нейритов гранул PDL так, чтобы он физически контактировал с нейритами.

Оставьте нейритный комплекс PDL в контакте с целевым нейритом, одновременно манипулируя второй микропипеткой. Затем опустите вторую пипетку со вторым шариком PDL поверх вновь образованного нейрита примерно в 20 микрометрах от первого шарика и используйте второй шарик PDL, чтобы протолкнуть новую нить нейрита к целевой ячейке. Далее удерживайте обе бусины на месте не менее одного часа.

Убедитесь в отсутствии очагового вздутия, утолщения нейритов, контактирующих с бусиной, с помощью микроскопа. В течение этого времени медленно меняйте среду образца с физиологического раствора на предварительно нагретый углекислый газ, уравновешенный НБМ. Освободите шарик от второй пипетки, отпустив всасывание.

Если новый нейрит остается прикрепленным, отпустите и первую бусину. После этого осторожно поместите образец обратно в инкубатор, чтобы укрепить нейронную связь для будущих экспериментов. Вы можете использовать записи клеточного патч-клетка для исследования электрической функциональности микроманипулируемого соединения.

Здесь показаны изолированные нейронные популяции, разделенные 100-микрометровым промежутком в микроустройствах PDMS. Запись парных зажимов была выполнена в конфигурации целых клеток, а механически индуцированные связи были проанализированы и сравнены с таковыми в естественно связанных нейронных популяциях и несвязанных популяциях. Электрические реакции после пресинаптического потенциала действия, зарегистрированного нейронами, соединенными естественным путем и с помощью микроманипуляций, значительно выше и временно коррелируют с пресинаптической активностью.

После освоения этой техники ее можно выполнить за восемь часов, если все сделано правильно, и при попытке выполнить эту процедуру важно помнить о наличии здоровых и хорошо структурированных долгосрочных клеточных культур, чтобы гарантировать быстрые и воспроизводимые результаты. После этой процедуры можно использовать различные методы для проверки электрической функциональности микроманипулируемого соединения. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выращивать клеточные популяции в микрофлюидных камерах, а также использовать манипуляции с пипетками для инициирования, расширения и подключения нейритов.