Неонатальная мышь Метод Cochlear Explant Technique как

Общая цель данной процедуры заключается в подготовке, культивировании, обработке и иммуноокрашивании эксплантатов улитки новорожденных мышей для их использования в качестве инструмента скрининга in vitro в исследованиях слуха. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области изучения слуха, например, обеспечить одновременное исследование волосковых клеток улитки, синапсов, нейритов и нейронов в модели ex vivo, а также дать представление о механизмах действия молекул, ранее не изучавшихся в улитке, включая факторы, содержащиеся в секретах человека. Основным преимуществом данной методики является возможность ускорить процесс скрининга потенциальных терапевтических соединений перед их тестированием in vivo.

Начните с использования свежесобранной головы новорожденного, помещенной в 70% ethanol в крышке чашки Петри. С помощью лезвия скальпеля сделайте поверхностный разрез кожи от переднего к заднему концу черепа. Затем разрежьте оба наружных слуховых прохода и отогните кожу вперед, чтобы обнажить весь череп.

Затем вскройте череп вдоль сагиттального шва, аккуратно перемещая лезвие скальпеля вверх и вниз в направлении от передней части к задней, чтобы избежать сдавления улитки. Удалите и утилизируйте рыло, сделав вертикальный разрез непосредственно позади глазниц. В задней части черепа должны остаться мозг и улитка.

Затем с помощью пинцета аккуратно препарируйте и удалите передний мозг, мозжечок и ствол мозга. Поместите две половины черепа в пластиковую чашку Петри диаметром 60 мм, наполненную холодным HBSS. Затем с помощью пинцета полностью обнажите улитку, которая расположена рядом с окружающей ее стременной артерией, и аккуратно отделите орган от височной кости.

Перенесите улитку в стеклянную чашку Петри с прозрачными стенками и плоским дном диаметром 50 мм, содержащую HBSS, и поместите чашку под микроскоп. Поместите пластиковую чашку Петри диаметром 60 мм с другой половиной черепа на лед. Затем с помощью 4 пинцетов осторожно подвергните диссекции костную капсулу улитки.

Теперь с помощью микроножа или двух пинцетов 55 осторожно отделите спиральную связку, прикрепленную к кортиеву органу, от остальной части улитки и медиального отдела. Это можно сделать, захватив спиральную связку в самой базальной части и плавно разматывая ее при движении в апикальном направлении. После удаления спиральной связки расположите образец так, чтобы получить продольный сагиттальный срез улитки.

Затем с помощью микроножа разрежьте улитку на два или три сегмента, разделяя их на апикальные и базальные витки. Удалите ткани, находящиеся выше более апикального фрагмента и ниже более базального, до самого слоя волосковых клеток и нейритов, чтобы эксплантат улитки мог лежать горизонтально на чашке Петри. Далее с помощью пинцета аккуратно захватите и удалите текториальную мембрану — очень тонкий полупрозрачный слой, расположенный непосредственно над кортиевым органом.

Наиболее сложным с технической точки зрения этапом, вероятно, является удаление тонкой полупрозрачной текториальной мембраны, так как можно легко повредить лежащие под ней волосковые клетки. Если начинать с краев ткани, волосковые клетки по всей длине экспланта сохраняются, за исключением самого края, где началось отслоение текториальной мембраны. Наконец, удалите мембрану Райсснера, расположенную непосредственно над нейронами спирального ганглия, захватив ее пинцетом с обеих сторон и отслоив.

Образец улитки готов к культивированию после удаления поврежденных участков по краям. Начните процедуру культивирования, смочив кончик дозатора объемом 1 мл примерно 120 µL DMEM, чтобы предотвратить прилипание экспланта к внутренней поверхности наконечника. Затем с помощью предварительно смоченного наконечника перенесите не более 70 µL жидкости из чашки Петри с стеклянным дном и поместите образец вместе с жидкостью в одну из четырех лунок четырехлуночной чашки Петри.

Под микроскопом проверьте, правильно ли ориентирован эксплантат. Убедитесь, что область волосковых клеток, из которой была удалена текториальная мембрана, обращена вверх, а базилярная мембрана вместе с обрезанной базальной частью медиальной стороны обращена вниз и прилегает к вставке покровного стекла. Если при осмотре обнаружится, что образец ориентирован неправильно, как показано здесь, добавьте HBSS из наконечника пипетки и переместите фрагмент до достижения правильной ориентации.

После правильного ориентирования экспланта аспирируйте избыток HBSS, затем подождите 15 секунд. Теперь с помощью пипетки нанесите 60 µL теплой культуральной среды непосредственно на образец, стараясь не касаться образца наконечником пипетки. Закройте внутреннюю и внешнюю крышки чашки Петри и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.

На следующий день перенесите чашки Петри с эксплантатами улитки из инкубатора в ламинарный шкаф. Аспирируйте из вкладыша старую культуральную среду, не содержащую FBS. Добавьте по 60 µL в каждую лунку подготовленной теплой среды для обработки.

Верните чашку Петри в инкубатор до момента окрашивания культур, которое проводится через максимум семь дней. Как видно на этом конфокальном изображении, данный метод позволяет сохранить анатомию всего витка улитки, включая нейроны спирального ганглия (SGN), что дает возможность анализировать воздействие терапии на нейриты и сомы SGN в дополнение к органу Кортеуси. Как показано здесь, такие эксплантаты могут быть использованы для одновременного сравнения эффекта воздействия на апикальный и базальный витки после иммунофлуоресцентного окрашивания.

Волосковые клетки показаны зеленым цветом, а нейронные структуры — красным. Сохранность синапсов можно оценить путем одновременного окрашивания пресинаптических белков (красным) и постсинаптических белков (зеленым) вместе с окрашиванием нейронных структур в синий цвет. На данном рисунке представлены репрезентативные изображения эксплантатов апикальной и базальной частей улитки после семи дней культивирования с 3% FBS (слева) или 1% FBS (справа).

Клетки, инкубируемые в 3% FBS, начинают мигрировать между четвертым и пятым днями, что показано светло-серыми стрелками для волосковых клеток и красными стрелками для нейритов. Экспланты в 1% FBS сохраняют организационную целостность до седьмого дня. При выполнении данной процедуры важно визуально убедиться в структурной целостности и ориентации ткани улитки перед добавлением окончательной питательной среды и исследуемых веществ.

После выполнения этой процедуры можно провести 3D-реконструкцию, чтобы подтвердить локализацию GFP-экспрессирующих клеток в определенном типе клеток внутри medialis.