Неонатальная мышь Метод Cochlear Explant Technique как In Vitro Инструмент скрининга в исследованиях слуха

Общей целью этой процедуры является подготовка, культивирование, лечение и иммуноокрашивание кохлеарных эксплантов мышей у новорожденных, которые будут использоваться в качестве инструмента скрининга in vitro при исследованиях слуха. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований слуха, такие как одновременное изучение волосковых клеток улитки, синапсов, невритов и нейронов в модели ex vivo и дать представление о механизмах действия новых для улитки молекул, включая факторы, обнаруженные в выделениях человека. Основное преимущество этой методики заключается в том, что процесс скрининга потенциальных терапевтических соединений может быть ускорен до их тестирования in vivo.

Начните со свежесобранной головы новорожденного, содержащейся в 70% этаноле в крышке чашки Петри. С помощью лезвия скальпеля сделайте поверхностный надрез на коже от переднего до заднего конца черепа. Затем разрежьте оба наружных слуховых прохода и сложите кожу спереди, чтобы обнажить весь череп.

Затем раскройте черепную коробку вдоль сагиттального шва, осторожно перемещая лезвие скальпеля вверх и вниз от переднего к заднему, чтобы избежать сдавливания улитки. Удалите и выбросьте рыло, сделав вертикальный надрез прямо позади орбит. Задняя часть черепа должна по-прежнему содержать мозг и улитку.

Затем с помощью 4 щипцов тупо препарируйте и утилизируйте передний мозг, мозжечок и ствол мозга. Поместите две половинки черепа в 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри, наполненную холодным HBSS. Затем с помощью 4 щипцов полностью обнажить улитку, которая прилегает к окружающей стапедиальной артерии, и тупо отделить орган от височной кости.

Перенесите улитку в чашку Петри с прозрачными стенками диаметром 50 миллиметров, содержащую HBSS, и поместите чашку под микроскоп. Поместите 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри другой половиной черепа на лед. Далее с помощью 4 щипцов тщательно рассеките капсулу улиткового глаза.

Теперь с помощью микроножа или двух щипцов 55 осторожно отделите спиральную связку, которая прилегает к кортиальному органу, от остальной части улитки и медиалиса. Это можно сделать, захватив спиральную связку за самую базальную сторону и аккуратно раскрутив ее во время апикального движения. После удаления спиральной связки расположите образец так, чтобы получить продольный сагиттальный вид улитки.

Затем разрежьте улитку на две или три части с помощью микроножа, классифицируя эти участки как апикальные и базальные повороты. Удалите верхнюю ткань для более апикальной части и нижнюю для более базальной части, вплоть до фактического слоя волосковых клеток и нейритов, чтобы позволить кохлеарному экспланту горизонтально лежать на чашке Петри. Затем с помощью щипцов аккуратно захватите и снимите текториальную мембрану, очень тонкий полупрозрачный слой, непосредственно превосходящий орган корти.

Наиболее технически сложным шагом, вероятно, является удаление тонкой полупрозрачной текториальной мембраны, так как можно легко повредить волосковые клетки под ней. Начиная с краев ткани, волосковые клетки сохраняются по всей длине экспланта, за исключением самого края, где началось отслаивание текториальной мембраны. Наконец, удалите мембрану Рейсснера, расположенную непосредственно над спиральными ганглиозными нейронами, прикоснувшись к ней щипцами с обеих сторон и отклеивая.

Теперь образец улитки готов к культивированию после удаления всех поврежденных участков по краям. Начните процедуру культивирования, смочив кончик пипетки объемом в один миллилитр примерно 120 микролитрами DMEM, чтобы предотвратить прилипание экспланта к внутренней стороне кончика. Затем с помощью предварительно смоченного наконечника наберите пипеткой максимум 70 микролитров из стеклянного дна чашки Петри и поместите образец вместе с жидкостью на одну из четырех вкладок в четырехлуночной чашке Петри.

Проверьте под микроскопом, что эксплант находится в правильной ориентации. Убедитесь, что область волосковых клеток, из которых была удалена текториальная мембрана, обращена вверх, а базилярная мембрана вместе с обрезанной базальной частью медиалиса обращена вниз и прилегает к покровной вкладке. Если при осмотре образец ориентирован вверх ногами, как показано здесь, добавьте HBSS с наконечника пипетки и переместите изделие до тех пор, пока он не будет правильно ориентирован.

Как только эксплант будет правильно ориентирован, аспирируйте избыток HBSS и подождите 15 секунд. Теперь нанесите пипетку объемом 60 микролитров теплой питательной среды непосредственно на образец, стараясь не касаться его пипеткой. Установите на место внутреннюю и внешнюю крышки чашки Петри и выдерживайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день перенесите кохлеарный эксплант, содержащий чашки Петри, из инкубатора в колпак с ламинарным потоком. Отсадите из инкрустации старую питательную среду, которая не содержит FBS. Добавьте 60 микролитров на лунку приготовленной теплой лечебной среды.

Поместите чашку Петри обратно в инкубатор до окрашивания культур максимум через семь дней. Как видно на этом конфокальном изображении, этот метод сохраняет анатомию всего кохлеарного поворота, включая спиральные ганглиозные нейроны или SGN, что позволяет анализировать влияние лечения на невриты и соматы SGN в дополнение к кортиевому органу. Как видно из рисунка, эти экспланты могут быть использованы для одновременного сравнения эффекта лечения на апикальном и базальном поворотах после иммунофлуоресцентного окрашивания.

Волосковые клетки обозначены зеленым цветом, а нейронные структуры – красным. Интактные синапсы можно оценить путем маркировки пресинаптических белков, показанных красным цветом, и постсинаптических белков, показанных зеленым, вместе с окрашиванием нейрональных структур в синий цвет. На этом рисунке представлены изображения апикальных и базальных кохлеарных эксплантов после семи дней в культуре с 3% FBS слева или 1% FBS справа.

Клетки, инкубированные при 3%-ном FBS, начинают мигрировать между четвертым и пятым днями, как показано светло-серыми стрелками для волосковых клеток и красными стрелками для нейритов. Экспланты в 1%FBS сохраняют организационную целостность до седьмого дня. При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости визуально убедиться в структурной целостности и ориентации ткани улитки, прежде чем добавлять конечную питательную среду и интересующие вещества.

После этой процедуры может быть выполнена 3D-реконструкция для подтверждения специфичной для типа клеток локализации GFP-экспрессирующих клеток в медиалисе.