Выделение Side населения в Myc-индуцированный Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз в данио рерио

Общая цель данной процедуры — изолировать клетки боковой популяции (side population) из модели острого лимфобластного лейкоза Т-клеток у zebrafish, индуцированного белком myc. Анализ боковой популяции использовался для идентификации популяций стволовых клеток и клеток-предшественников во многих нормальных и раковых тканях, однако он еще не применялся ни в одной из моделей рака у zebrafish.

Основным преимуществом данной методики является возможность проспективной изоляции популяции клеток T-ALL у данио-рерио, которая может быть обогащена клетками с активностью раковых стволовых клеток. Хотя описанный здесь метод имеет широкое применение в исследованиях лейкемии у данио-рерио, он также может быть применим к другим злокачественным и незалокачественным типам клеток этой рыбки. Лица, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как методика чувствительна к незначительным изменениям.

Несмотря на то, что метод кажется простым, для каждого тестируемого типа клеток требуется оптимизация. Приготовьте 20 мл 10% термоинактивированной FBS в 0.9x PBS. Добавьте один мл раствора FBS/PBS в флакон с солью натрия гепарина, содержащий 300 единиц антикоагулянта.

Затем с помощью эпифлуоресцентного микроскопа отберите рыб, у которых опухолевые клетки захватили 50% тела, или рыб с выявленными нарушениями питания или плавания. Проведите эвтаназию рыб, перенеся их в раствор трикаина в рыбной воде с концентрацией от 1 до 2 mg/mL. Убедитесь в наступлении смерти животного, проверив отсутствие движений жабр и сердцебиения.

После удаления головы рыбы введите с помощью пипетки 100 microliters раствора гепарина в полость тела для удаления избытка эритроцитов. Аспирируйте всю вытекающую жидкость и перенесите ее в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliter. Затем, используя новые наконечники для пипетки, промойте полость тела еще два раза или до тех пор, пока промывочный раствор не перестанет содержать кровь; жидкость, собранную при всех промывках, утилизируйте.

Для сбора лейкозных клеток введите 100 µL раствора FBS/PBS в предварительно промытую брюшную полость. Под dissecting microscope осторожно надавите на тело рыбы наконечником пипетки, чтобы вытеснить опухолевые клетки. Соберите выделившуюся жидкость в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL.

Повторяйте выделение до тех пор, пока не будет собрано большинство опухолевых клеток. Соберите все клетки в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и храните полученную суспензию при комнатной температуре. Затем перемешайте выделенные опухолевые клетки, аккуратно дозируя их пипеткой, чтобы разогнать клеточные конгломераты.

Профильтруйте суспензию клеток через фильтр с размером пор 40 мкм. Промойте фильтр один или два раза 100 мкл FBS/PBS. После фильтрации храните клетки при комнатной температуре.

Наконец, в новой пробирке смешайте 2 µL клеточной суспензии с 18 µL 0,04% стерильного раствора трипанового синего. Нанесите 10 µL полученной суспензии в гемоцитометр и подсчитайте количество жизнеспособных флуоресцентных опухолевых клеток. Важно собрать чистую пробу клеток T-ALL.

Концентрация красителя Hoechst 33342, используемая в данной работе, рассчитана исходя из количества собранных живых опухолевых клеток. Присутствие клеточного дебриса или непухолевых клеток может помешать проведению анализа. Перед окрашиванием клеток разведите краситель Hoechst в воде, свободной от нуклеаз, для получения рабочего раствора с концентрацией 1 mg/mL.

Храните приготовленный раствор, накрыв его алюминиевой фольгой, при температуре 4 °C. Затем растворите 49,1 mg верапамила в 1 mL DMSO для получения 100 µM раствора ингибитора. После этого подготовьте образец, добавив FBS/PBS, 2,5 µL DMSO, 15 µL красителя Hoechst в концентрации 1 mg/mL и 10⁶ опухолевых клеток в пробирку типа фалькон так, чтобы конечный объем составил 1 mL.

Для подготовки контроля добавьте FBS/PBS, 2,5 µL верапамила в концентрации 100 мМ и 15 µL красителя Hoechst в концентрации 1 mg/mL к 10⁶ опухолевых клеток, доведя конечный объем до 1 mL. Инкубируйте образец и контроль в водяной бане при температуре 28 °C в темноте в течение 120 минут. После инкубации немедленно поместите клетки на лед и храните их в темноте.

Центрифугируйте клетки при 300 ×g при температуре 4 °C в течение шести минут. Затем удалите супернатант и промойте клетки 1 мл FBS/PBS. Повторно центрифугируйте клетки при 300 ×g при температуре 4 °C в течение шести минут.

После центрифугирования клеток удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре FBS/PBS. Храните образцы при температуре четырех градусов Цельсия до проведения сортировки клеток. За 15 минут до начала сортировки клеток добавьте два микролитра стокового раствора пропидийиодида в концентрации один миллиграмм на миллилитр на каждый один миллилитр клеточной суспензии.

Затем тщательно перемешайте образцы на вортексе. Проанализируйте окрашенные суспензии клеток T-ALL данио-рерио с помощью флуоресцентного сортера клеток. Для анализа красителя Hoechst используйте возбуждение образцов УФ-лазером, а для детектирования T-ALL клеток, положительных по пропидиодиду или GFP, — лазером с длиной волны 488 нанометров.

Количество клеток, концентрация красителя, температура и продолжительность инкубации могут требовать оптимизации для каждого используемого типа клеток. Изменение любого из этих условий может существенно повлиять на результаты анализа. Чтобы идентифицировать боковую популяцию среди клеток T-ALL, выделенных из zebrafish, сначала исключают клеточный детрит и скопления клеток.

Затем анализируют поглощение пропидий иодида и экспрессию GFP в единой популяции клеток для идентификации живых опухолевых клеток. Для визуализации боковой популяции (side population) сравнивают синюю и красную эмиссии красителя Hoechst. Боковая популяция выглядит как слабо выраженный «хвост» клеток, простирающийся от левой стороны основной популяции клеток в сторону оси синей флуоресценции.

Здесь представлены результаты анализа side population, проведенного для двух различных образцов опухолевых клеток. Side population была выявлена в обоих образцах. Однако в разных образцах опухоли содержалось различное количество клеток side population.

Независимо от анализируемого образца опухоли, обработка образца верапамилом, который является ингибитором эффлюкса, приводила к исчезновению сигнала, наблюдавшегося для ранее идентифицированных клеток, что дополнительно подтверждало фенотип боковой популяции. После освоения методики выделения боковой популяции из T-ALL данио-рерио ее выполнение может занять менее четырех часов, если процедура проводится правильно и в соответствии с нашим представлением. При выполнении данной процедуры важно помнить о параметрах, оптимизированных для T-ALL данио-рерио, таких как температура и время инкубации, концентрация красителя и выбор ингибитора эффлюкса.

Возможно, эти параметры потребуют изменения для различных экспериментальных систем. После выполнения данной процедуры с отсортированными клетками боковой популяции можно провести другие исследования, такие как изоляция РНК или анализы трансплантации in vivo, чтобы изучить функциональную активность и генную регуляцию клеток боковой популяции. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как изолировать боковую популяцию клеток при остром лимфобластном лейкозе T-клеток у zebrafish.