Дифференцирование хондроцитов из периферических кроветворных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общей целью этой процедуры является получение хондрогенных линейных клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из периферической крови человека, или клеток IPS. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации хряща об использовании полученных от пациента клеток периферической крови в качестве С-клеток для создания IPS-клеток для восстановления хряща. Основные преимущества данной методики заключаются в том, что она легко воспроизводима, а дифференцировка хондроцитов происходит в условиях отсутствия сывороток и ксено.

Начните с помещения человеческих IPS-клеток в четыре миллилитра человеческой среды IPSC на 60-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую монослой облученных эмбриональных клеток фибробластов мыши. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в пятипроцентном углекислом газе. Когда стволовые клетки слились на 80-90 процентов, диссоциируйте клетки с помощью раствора диспейса для субкультивирования.

После двух-трех проходов используйте стеклянную иглу, вытянутую огнем, чтобы расчленить 80-90-процентную сливающуюся недифференцированную колонию IPSC на более мелкие фрагменты и перенесите не более 100 кусочков клеточной культуры в новую неадгезивную 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров эмбриоидной среды для формирования тела. Механическая диссоциация лучше, чем автоматическое разложение, потому что она уменьшает повреждение клеток до теперь уже небольших фрагментов клеток, которые должны быть перенесены в новый контейнер для культуры, и позволяет вручную избавиться от фидерных клеток, которые подавляют дифференцировку клеток IPS человека. Верните человеческие IPS-клетки в инкубатор для клеточных культур.

Через два дня наклоните чашку, чтобы эмбриоидные тела остыли, и осторожно замените три миллилитра эмбриоидной среды для формирования тел четырьмя миллилитрами свежей базальной питательной среды. Через 10 дней сформируются эмбриоидные тела. Покройте новую 100-миллиметровую посуду четырьмя миллилитрами 0,1-процентного желатина в течение 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию.

Перенесите эмбриоидные тела с надосадочной жидкостью в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и дайте телам отстояться в течение четырех-пяти минут. Аспирируйте все, кроме последних 0,5 миллилитров среды, и ресуспендируйте эмбриоидные тельца в 10 миллилитрах свежей базальной питательной среды. Когда желатин застынет, выбросьте желатин.

Затем посадите клетки на покрытую желатином чашку и поместите чашку в инкубатор для клеточных культур. После 10 дней в культуре эмбриоидные тельца дифференцируются в выросты фибробластических клеток. Чтобы вызвать дифференцировку хондроцитов, промойте культуру с помощью DPBS и отделите клетки тремя миллилитрами 0,25-процентного трипсина ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Когда клетки поднимутся со дна планшета, нейтрализуйте реакцию четырьмя миллилитрами свежей базальной питательной среды и осторожно титруйте культуру от пяти до 10 раз. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновое сетчатое сетчатое фильтр толщиной 70 микрон и соберите клетки путем центрифугирования. Затем высадите клетки на новую покрытую желатином 100-миллиметровую пластину в 10 миллилитрах свежей базальной питательной среды.

Когда культура достигает 90-100-процентной конфлюенции, соберите из клеток три миллилитра 0,25-процентного трипсина ЭДТА, как только что было продемонстрировано для подсчета. Переложите трижды по 10 в пятую аликвоту клеток в полипропиленовую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования. И ресуспендировать гранулу в одном миллилитре хондрогенной дифференцировочной среды.

Затем снова центрифугируйте клетки и поместите пробирку в инкубатор для клеточных культур на 21 день, не повреждая гранулу. Хондрогенные клетки могут собираться in vitro, производя характерные внеклеточные метрики в условиях культивирования с высокой плотностью. После 21 дня в культуре образуется хондрогенная гранула человеческой IPS-клетки.

После 21 дня культивирования хондрогенные клетки IPSC человека положительно реагируют на алциановый синий и толуидин при окрашивании синим, что указывает на успешную хондрогенную дифференцировку гранулы HIPSC. Иммуногистохимический анализ коллагена 2 и коллагена 10 еще раз подтверждает их хондроцитоподобный фенотип. Анализ сульфатированных гликозаминогликанов показывает, что содержание сульфатированных гликозаминогликанов в клетках значительно повышено в хондрогенных гранулах IPSC человека по сравнению с фибробластическими клетками человека IPSC, эмбриоидными тельцами и недифференцированными клетками IPS человека.

Кроме того, хондрогенные клетки IPSC человека демонстрируют высокий уровень экспрессии генов линии хондропрогениторов и полностью дифференцированных маркеров хондроцитов, что позволяет предположить достижение успешной хондрогенной дифференцировки. Метод многоступенчатого культивирования, используемый для дифференцировки IPSC человека в хондроциты, включая спонтанную дифференцировку через образование БЭ, рост клеток из БЭ, монослойную культуру клеток после клеточной культуры и 3D-культуру гранул. Фенотип хондроцитов оценивается с помощью гистологического анализа, биохимического анализа и экспрессии хондрогенных генов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать метод многоступенчатой культуры для индуцирования дифференцировки IPS-клеток человека в хондроциты. Этот метод может быть более специфичным для пациента и экономически эффективным.