Системные поставки микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированный вирус серотипа 9 для лечения нервно-мышечных заболеваний у грызунов
10 августа 2018 г.
Здесь мы описываем доставки микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированный вирус серотипа 9 в мышиной модели нервно-мышечных заболеваний. Один периферийных администрации в мышах привели к устойчивой Мирна гиперэкспрессия в мышцы и двигательных нейронов, обеспечивая возможность для изучения Мирна функции и терапевтический потенциал в vivo.
Общая цель этого метода заключается в выборе и доставке микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора. Затем доставить его в скелетные мышцы и двигательные нейроны мышей и оценить их эффективность в улучшении фенотипов заболевания. Этот метод может помочь ответить на важный вопрос о том, можно ли использовать стратегию сайленсинга на основе микроРНК для лечения нервно-мышечных заболеваний.
Основным преимуществом этой методики является использование аденоассоциированного вируса серотипа 9 для доставки микроРНК через системный кровоток к спинному мозгу и скелетным мышцам мышей, чтобы напрямую заглушить ген-мишень заболевания. Разделите плазмидный запас AAV-микроРНК на аликвоты объемом от 100 до 200 микролитров, содержащие вирусную нагрузку от десяти до ста триллионов геномов на миллилитр. Далее загрузите одну аликвоту в шприц и прикрепите к нему иглу от 27 до 30 калибра.
Теперь, используя стандартный удерживатель для мыши, закрепите мышь с открытым хвостом. Затем очистите хвост от 70% спирта и подложите теплую прокладку под хвост примерно на 30 секунд, чтобы увеличить расширение сосудов. Теперь в дистальной части хвоста введите иглу в хвостовую вену скосом вверх и под небольшим углом, примерно на 15 градусов.
Затем введите вирус и подождите несколько секунд, прежде чем удалить иглу. После извлечения иглы надавите двумя пальцами на умеренное давление, чтобы остановить кровотечение. Затем верните животное в его домашнюю клетку.
Во время инъекции в хвостовую вену нередко можно увидеть вспышку крови в ступице иглы. Во время введения сопротивления быть не должно. Если хвост начинает бледнеть и опухать, удалите иглу и повторите попытку проксимальнее предыдущего места входа.
Для проведения этих тестов мыши должны быть старше четырех недель, и перед лечением они должны быть уверены в базовом уровне. В помещении для тестирования должно быть тихо и темно, без помех. Заведите мышей в помещение не менее чем за 30 минут до проведения любых тестов.
Не беспокойте животных в этот период акклиматизации. Начните с теста с подвесным тросом. Возьмите мышь за хвостик и поместите его в центр проволочной сетки.
Затем поднимите сетку на 15-20 дюймов и медленно инвертируйте экран, чтобы дать мыши время отрегулировать хват. Как только сетка полностью перевернится, запустите таймер и запишите время выпадения. Дайте мышке повиснуть на ней 60 секунд, если она упадет раньше, то верните ее в сетку и повторите процедуру.
Если мышь зависает на полных 60 секунд, зарегистрируйте 60 секунд для подсчета очков и верните мышь в корзину. Дайте каждой мышке три попытки на руку 60 секунд. В противном случае забейте наибольшее время зависания.
После усыпления мыши собирают материал из спинного мозга, а затем из четырехглавой мышцы скелета. Чтобы быстро заморозить собранные ткани, наполовину заполните миску из нержавеющей стали 2-метилбутаном и погрузите нижнюю четверть миски в жидкий азот. Подождите две минуты, прежде чем продолжить.
Через несколько минут перенесите образец в 2-метилбутан. Когда образец побелеет, сразу же переложите его в емкость, погруженную в сухой лед. Позже храните образец при температуре 80 градусов Цельсия.
Для биохимического анализа и количественного определения микроРНК собранную ткань поместите в криовиальную камеру и заморозьте ее в жидком азоте. Затем храните его при температуре 80 градусов по Цельсию. Мышам SBMA вводили сто триллионов геномов AAV microR-298 в возрасте пяти недель.
Мыши SBMA несут трансген рецептора андрогена человека с аномально расширенным полиглутаминовым трактом. К десяти неделям у них обычно развиваются признаки нервно-мышечного заболевания. Поясничный отдел спинного мозга и четырехглавая мышца были собраны в несколько временных точек после лечения для анализа.
Количественная ОТ-ПЦР показала, что экспрессия micro-R298 достигла пика в скелетных мышцах через восемь недель, а экспрессия достигла пика в спинном мозге через 12 недель. Через десять недель после инъекции GFP был обнаружен в обеих тканях. А экспрессия GFP локализована совместно с маркером моторных нейронов холинацетилтрансферазой.
В последующем эксперименте мышам случайным образом вводили вирус или носитель в возрасте семи недель, а затем взвешивали и анализировали поведение еженедельно, вплоть до 40-недельного возраста. Через десять недель после инъекции обработанные мыши начали набирать вес и начали демонстрировать улучшение двигательных функций. Количественная ПЦР в реальном времени показала, что лечение снижает уровень транскрипта AR в пораженных тканях.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как доставить микроРНК с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора с помощью впрыскивания. И как проводить поведенческие анализы, которые могут помочь оценить эффективность доставляемой микроРНК в улучшении атрофии и слабости нижних конечностей у мышей. Применение этого метода распространяется и на подходы генной терапии, поскольку безопасная и эффективная генная терапия требует специфического переноса терапевтического трансгена в целевые ткани.
Впервые у нас появилась идея этого метода, когда мы поняли, что заболевание, вызванное токсическим усилением функциональных механизмов, таких как SBMA, выиграет от чрезмерной экспрессии встречающихся в природе микроРНК, специально нацеленных на репарацию трех простых чисел болезненного транскрипта.
Обзор
В данной статье представлен метод доставки микроРНК (миРНК) с использованием вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) для воздействия на скелетные мышцы и мотонейроны на мышиной модели спинальной и бульбарной мышечной атрофии (SBMA). Целью данного подхода является оценка эффективности миРНК-опосредованного сайленсинга генов в облегчении фенотипов нервно-мышечных заболеваний, что имеет значение для генной терапии расстройств, связанных с токсической функцией усиления.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная терапия
- Исследование нервно-мышечных заболеваний
- Молекулярная нейробиология
Теоретические основы
- РНК-интерференция через эндогенные пути miRNA регулирует экспрессию генов посттранскрипционно.
- Регуляция генов с помощью miRNA является перспективной терапевтической стратегией при неврологических расстройствах, вызванных токсичными мутациями с приобретением функции.
- Эффективная доставка терапевтических miRNA в ткани-мишени остается серьезной проблемой.
- SBMA — это нервно-мышечное заболевание, вызванное экспансией полиглутамина в гене андрогенного рецептора (AR).
Цель исследования
- Проверить, может ли гиперэкспрессия недавно идентифицированной miRNA, воздействующей на AR (miR-298), облегчить фенотипы заболевания у мышей с SBMA.
- Оценить эффективность системной доставки miR-298 с помощью векторов rAAV9.
- Оценить влияние miR-298 на уровни транскриптов AR и нервно-мышечную функцию.
Используемые методы
- Подготовка векторов rAAV9, кодирующих miR-298, с разделением на порции для инъекций.
- Системное введение путем инъекции в хвостовую вену мышам с SBMA с использованием иглы калибра 27–30 G.
- Поведенческая оценка с помощью теста на удержание на подвешенной проволоке для анализа двигательной функции.
- Сбор тканей (спинного мозга и четырехглавой мышцы бедра) для биохимического анализа и количественного определения miRNA методом количественной RT-PCR.
- Иммунофлуоресцентный анализ для детекции экспрессии GFP и ее колокализации с маркерами мотонейронов.
Основные результаты
- Инъекция rAAV9-miR-298 в хвостовую вену привела к стойкой и широкомасштабной гиперэкспрессии miR-298 в скелетных мышцах и мотонейронах.
- Экспрессия miR-298 достигла пика в скелетных мышцах через 8 недель и в спинном мозге через 12 недель после инъекции.
- Репортер GFP подтвердил успешную трансдукцию и колокализацию с маркерами мотонейронов.
- У мышей с моделью SBMA, прошедших лечение, наблюдалось улучшение прибавки в весе и двигательных функций по сравнению с контрольной группой.
- Количественная RT-PCR показала снижение уровней транскриптов AR в пораженных тканях после лечения.
Выводы
- Системное введение miR-298 с помощью rAAV9 эффективно для воздействия на скелетные мышцы и мотонейроны у мышей с моделью SBMA.
- Оверэкспрессия miR-298 улучшает нервно-мышечные фенотипы и снижает уровни патогенных транскриптов AR.
- Данный подход демонстрирует потенциал стратегий сайленсинга генов на основе miRNA для лечения нервно-мышечных заболеваний, вызванных токсическими мутациями с приобретением функции.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Системная доставка микроРНК с использованием векторов rAAV9 обеспечивает таргетный сайленсинг генов в нервно-мышечных тканях, что позволяет решить одну из ключевых проблем терапевтической РНК-интерференции при заболеваниях с токсической функцией усиления. Данный подход повышает прогностическую достоверность в отношении взаимодействия с мишенью и измерения функционального результата, что оказывает прямое влияние на решения на этапах раннего поиска и разработки трансляционных пайплайнов. Способность метода обеспечивать устойчивую тканеспецифическую модуляцию генов болезни позволяет использовать его в качестве универсальной платформы для инноваций в генной терапии портфеля нервно-мышечных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую изучать функцию генов заболевания посредством сайленсинга с помощью miRNA in vivo.
- Способствует снижению биологических рисков путем подтверждения взаимодействия с мишенью в соответствующих тканях.
- Повышает прогностическую достоверность при проверке терапевтических гипотез для нервно-мышечных заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных моделей животных для последующих поведенческих и молекулярных анализов.
- Стандартизация доставки и количественного определения агентов сайленсинга генов в различных когортах.
- Обеспечение воспроизводимого измерения двигательной функции и снижения уровня транскриптов в качестве количественных показателей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний, имеющим значение для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от исследования механизмов до оценки доклинической эффективности.
- Поддерживает продвижение проекта с учетом рисков путем установления связи между молекулярными и функциональными конечными точками.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод системной доставки miRNA связывает этапы предварительного поиска, валидации мишеней и доклинической оценки эффективности на моделях нервно-мышечных заболеваний.
- Биология открытий: демонстрирует проверку гипотез in vivo и уточнение путей для мишеней с токсическим приобретением функции.
- Скрининг: подтверждает готовность и воспроизводимость анализа для поведенческих и молекулярных конечных точек.
- Аналитика: предоставляет количественные данные RT-PCR и показатели поведения для сравнения между различными условиями.
- Трансляционные исследования: связывают эффективность сайленсинга генов с функциональным улучшением в системах, релевантных для данного заболевания.
- Корпоративное повторное использование: предлагает масштабируемую платформу для оценки дополнительных кандидатов miRNA или мишеней заболевания.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в стратегиях генной терапии.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированную, масштабируемую и воспроизводимую модуляцию генов in vivo.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет установления связи между молекулярными и фенотипическими результатами.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию кандидатов для генной терапии при нейромышечных показаниях с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке вирусных векторов и методах доставки in vivo.
- Необходим доступ к инфраструктуре для проведения количественных молекулярных и поведенческих анализов.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов инъекций, забора тканей и анализа.
- Может потребоваться адаптация для различных последовательностей miRNA или моделей заболеваний.
- Практические ограничения включают дозирование вектора, специфичность тканей и мониторинг долгосрочной экспрессии.
