Минимально инвазивные мышц, встраивание (MIME) - роман Экспериментальная техника для содействия доноров Cell-Mediated ультраструктур

Общая цель этого метода заключается в имплантации небольшого сегмента донорской мышечной ткани в мышцу-хозяина, чтобы способствовать миогенезу, опосредованному донорскими клетками. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной мышечной биологии, такие как может ли мышечная ткань, собранная после смерти, способствовать миогенезу, опосредованному донорскими клетками, в мышце-хозяине. Главное преимущество этой методики в том, что она малоинвазивна.

Применение этой техники распространяется на терапию нелетальных мышечных дистрофий, потому что комбинация наращивания мышц, физических упражнений и иммунотерапии может быть способна омолодить регенеративный потенциал определенных пораженных мышц. Как физиотерапевт и биомедицинский инженер, я считаю, что минимально инвазивный характер процедуры MIME является ключевым, потому что она обеспечивает источник миогенных клеток, а также естественный тканевый каркас без чрезмерного нарушения структуры и функции мышц хозяина. Демонстрировать процедуру будет мисс Мориум Бегам, научный сотрудник моей лаборатории.

Для начала усыпьте 12-16-недельных черных шести донорских мышей C57, как описано в текстовом протоколе. С помощью хирургических ножниц вскройте кожу над передней поверхностью задней ноги. Найдя мышцу ТА, удалите ее, чтобы визуализировать мышцу EDL, расположенную за мышцей ТА.

Сдвиньте кончик щипцов за мышцу и осторожно потяните, чтобы увидеть, разгибаются ли пальцы ног, подтверждая, что мышца является EDL. После определения мышцы EDL используйте сегменты шелка длиной около 10 сантиметров из шелка 4-0, чтобы завязать направляющие швы на дистальном и проксимальном отделах сухожилий. Сделайте два двойных узла в швы проксимального и дистального отделов мышцы.

Разрежьте дистальное сухожилие EDL и отразите мышцу. Затем разрежьте проксимальное сухожилие, чтобы освободить мышцу. Поместите собранные мышцы EDL в чашку Петри, наполненную раствором для мыши Ringer.

Обезболите самца мыши-хозяина NSG-GFP в возрасте от 8 до 10 недель, согласно текстовому протоколу. Нанесите вазелин на глаза, чтобы предотвратить сухость. Чтобы подготовить кожу, нанесите крем для депиляции на переднюю часть левой задней ноги и оставьте его на две минуты.

С помощью смоченных в PBS салфеток удалите крем для депиляции вместе с шерстью. Чтобы очистить кожу, чередуйте скрабирование с тремя салфетками раствора повидон-йода и 70% этанола. Чтобы создать игольчатый тракт в мышце хозяина ТА, проведите хирургическую иглу через центр мышцы вдоль длинной оси мышцы.

Убедитесь, что игла проходит в цефало-каудальном направлении, по длине мышцы ТА и через центр мышечного живота. После введения иглы проведите направляющие швы с одного конца донорской ткани, через просвет хирургической иглы в каудо-цефальном направлении. Отведите иглу от мышцы хозяина в каудо-цефальном направлении, чтобы направить донорскую ткань через игольчатый тракт.

Правильно поместите ткань донорской EDL-мышцы в мышцу TA хозяина, используйте направляющие швы на каудальном и головном концах донорской мышцы. После введения донорской ткани срежьте направляющие швы и внесите любые коррективы с помощью щипцов с тонким наконечником. Наконец, запечатайте раны от иглы в мышечной ткани, закрыв раневую вмятину щипцами и нанеся ветеринарный тканевый клей кончиком хирургической иглы 27 калибра.

После MIME введите от 50 до 60 микролитров 1,2% хлорида бария в мышцу хозяина в три места по длине мышцы, проксимальную, среднюю и дистальную треть мышечного живота. После инъекции очистите ногу мыши-хозяина этанолом и защитите кожу, нанеся тонкий слой вазелина. Поместите мышь в одиночную клетку для восстановления без подстилки.

Изотермическая гелевая грелка должна быть помещена под половину клетки, чтобы обеспечить тепловую поддержку мыши хозяина, в то же время позволяя мыши перемещаться на необогреваемую половину. После завершения восстановления верните мышь в исходную клетку. С помощью хирургических ножниц вскройте кожу над передней поверхностью ноги.

После обнаружения мышцы ТА разрежьте ее дистальное сухожилие и отразите мышцу. Разрежьте сухожилие проксимальной мышцы, чтобы освободить мышцу ТА. Соберите как левую или обработанную, так и правую или контрольную мышцу ТА.

Взвесьте собранные мышцы, поместив их на бумагу для весов и весы. Для криозащиты кратковременно окуните мышцы в минеральное масло, а затем промокните излишки масла. Чтобы заморозить мышцы, поместите их на алюминиевую фольгу и быстро погрузите в двойную колбу, наполненную жидким азотом.

Переложите замороженные образцы в промаркированные криогенные флаконы. Точное встраивание донорской ткани в мышцу хозяина имеет решающее значение для успеха MIME. Через три дня донорская мышца EDL остается имплантированной в мышцу хозяина с следами от игл, все еще видимыми на мышце хозяина.

Кроме того, поперечные срезы донорских мышц не показывают зеленую флуоресценцию. В то время как поперечное сечение мышц хозяина — да. В поперечных срезах имплантированных мышц существует четкая граница между мышечными волокнами GFP положительной оболочки и волокнами отрицательного донора GFP.

Через 14 дней после лечения все мышечные волокна и необработанные мышцы являются GFP-положительными. Но не в обработанных мышцах хозяина. Многие из этих отрицательных волокон GFP показали свою жизнеспособность при маркировке красным десмином.

Это демонстрирует, что MIME приводит к миогенезу, полученному из донорских клеток. В мышце ТА присутствуют химерные мышечные волокна. Обнаруживаются по их низкой или умеренной флуоресценции, вероятно, возникающей в результате слияния миогенных клеток хозяина и донора.

Их присутствие по всему диаметру мышцы хозяина позволяет предположить, что донорские миогенные клетки могут мигрировать в пределах мышцы на несколько сотен микрон. После освоения этой техники ее можно выполнить за 15-20 минут, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать технику MIME для встраивания сегмента донорской мышцы в мышцу-хозяина, чтобы облегчить миогенез, опосредованный донорскими клетками.

Метод MIME прокладывает нам путь к изучению того, могут ли трупные мышцы человека способствовать миогенезу, опосредованному донорскими клетками, у мыши-хозяина. Это также помогает оценить, способна ли нервно-мышечная электростимуляция усиливать миогенез, опосредованный донорскими клетками. Этот метод также может быть применен к другим системам, таким как создание животных моделей заболеваний человека путем встраивания биопсийных мышц человека в организм животных-хозяев и для проверки того, могут ли миметики мышечной ткани, содержащие миогенные клетки, способствовать миогенезу.