Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения

Общая цель нативного электрофореза в сочетании с анализами на геле, иммуноблоттингом и нативным электроэлюированием заключается в сохранении и анализе сборки митохондриальных суперкомплексов. Этот метод может помочь ответить на вопрос, как белковые комплексы митохондриальной цепи переноса электронов собираются в суперкомплексы в зависимости от многих факторов, включая биоэнергетические потребности, а также физиологические и патологические состояния. Основное преимущество этой методики заключается в том, что при правильном выполнении физиологическая целостность и функциональность митохондриальных суперкомплексов сохраняется на протяжении всего длительного процесса изоляции.

Этот метод также может быть применен для изучения динамики сборки сверхкомплексов и анализа белковых комплексов в плазматической мембране, а также в других внутриклеточных мембранах. При подготовке к анализу в геле крайне важно, чтобы все детали, используемые для нативного электрофореза, не были загрязнены детергентами, так как они будут способствовать распаду митохондриальных суперкомплексов. Вырежьте одну или несколько дорожек из прозрачного натурального геля и переложите их в контейнер с этикеткой.

Для проведения анализа комплекс-1 соедините 10 миллилитров буфера для анализа с 25 миллиграммами тетразолия нитросинего и 100 микролитрами 10 миллиграммов на миллилитр НАДН. Добавьте его к вырезанной прозрачной нативной гелевой дорожке или области интереса. Следите за развитием синих полос после легкого помешивания на коромысле не менее трех минут.

Затем зафиксируйте гель в 10-20 миллилитровых растворах уксусной кислоты или промойте в пяти миллимолярах при pH 7,4, чтобы остановить реакцию. Сделайте фотографии для документации. Для проведения анализа комплекса-5 необходимо получить гель, полосу или область интереса из синего нативного или прозрачного нативного геля.

Инкубируйте образец в течение двух часов при осторожном перемешивании в 10-20 миллилитров буфера для анализа, плюс-минус пять микрограммов на миллилитр олигомицина при комнатной температуре. После инкубации замените буфер на 14 миллилитров свежего пробирного буфера. Затем добавьте по порядку 190 микролитров одного молярного сульфата магния, 27,28 миллиграмм нитрата свинца, 60 миллиграммов АТФ и 75 микролитров олигомицина.

Инкубируйте с легким перемешиванием и следите за белым осадком, так как полосы на обработанных олигомицином гелях дадут несложные 5 зависимых полос. Закрепите гель в фиксаторе на основе метанола, потому что кислотные растворы растворят осадок свинца. Сфотографируйте результаты, а затем проведите перенос белка и иммуноблоттинг, как описано в текстовом протоколе.

В день электроэлюирования поместите фритту на дно каждой стеклянной трубки, которую вы будете использовать. При необходимости поместите стеклянную трубку в элюирующий буфер и протолкните фритту изнутри на дно трубки. Вставьте стеклянную трубку с фриттой в модуль электроэлютера.

Намочите втулку с помощью элюирующего буфера и вставьте стеклянную трубку на место. Убедитесь, что верхушки стеклянных трубок находятся на одном уровне с втулкой. Закройте пустые люверсы пробками.

Затем поместите влажный колпачок мембраны на дно силиконового адаптера и заполните адаптер буфером для элюирования. Медленно пипетируйте буфер и адаптер вверх и вниз, чтобы удалить пузырьки воздуха вокруг диализной мембраны. Сдвиньте адаптер, заполненный буфером, на дно стеклянной трубки.

Затем удалите все пузырьки, которые появляются на фритте внутри стеклянной трубки. Заполните каждую стеклянную трубку элюирующим буфером. Поместите вырезанные ленты BN-PAGE в стеклянные пробирки.

Крупные куски нарезаем на более мелкие. Убедитесь, что высота заполнения стеклянной трубки составляет около одного сантиметра. Затем поместите весь модуль в бак.

Добавьте в бак около 600 миллилитров буфера для холодного элюирования. Убедитесь, что силиконовые переходные колпачки погружены в буфер. Поместите мешалку на дно резервуара, прежде чем элюировать белки в течение четырех часов при напряжении 350 вольт в холодном помещении.

После завершения элюирования извлеките модуль Electro-Eluter из буферного бака и поместите его в раковину или миску. Если использовалась пробка, снимите ее, чтобы слить воду из верхней буферной камеры. Снимите буфер с каждой стеклянной трубки и выбросьте его.

Убедитесь, что силиконовый адаптер остается на месте, а жидкость под фриттой не тревожится и не встряхивается. Затем осторожно снимите силиконовый адаптер вместе с мембранным колпачком со дна стеклянной трубки. Пипеткой наденьте содержимое силиконового колпачка в микропробирку.

Еще 200 микролитрами буфера для элюирования промойте силиконовый колпачок и добавьте в микропробирку. Повторите этот процесс для всех стеклянных трубок. Сохраните многоразовые мембранные колпачки, поместив их в элюирующий буфер, содержащий 0,5 миллиграмма на миллилитр азида натрия, и охладите.

Суперкомплексы из митохондрий сердца визуализируются здесь с помощью анализов в геле. Дорожки прозрачного нативного геля используются для внутригелевых анализов комплекса-1 и комплекса-5. Специфичность сигнала можно оценить с помощью ингибиторов, таких как олигомицин для АТФ-синтазы.

Анализы в геле дают информацию о размере белкового комплекса с активностью комплекса-1 или комплекса-5, но не об их составе. Синий нативный гель показывает полосы белковых комплексов, которые могут быть удалены для электроэлюирования. После электроэлюирования элюат используется для дальнейшего анализа, такого как внутригельные анализы, окрашивание элюированных белков серебром с помощью нативного или денатурирующего электрофореза и вестерн-блоттинг.

После освоения этой техники ее можно выполнить в течение трех дней, если она выполнена правильно. Эти три дня включают в себя изоляцию митохондрий, выполнение ночного синего нативного макси-электрофореза и иммуноблоттинг. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и идентифицировать митохондриальные суперкомплексы с помощью нативного электрофореза, анализов в геле и электроэлюирования.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что митохондриальные суперкомплексы хрупкие. Замораживание и размораживание образцов должно быть сведено к минимуму. Нативный электрофорез и электроэлюирование следует проводить на льду или в холодном помещении.

Последствия этих методов выходят за рамки определения физического состава каждого сверхкомплекса. Поскольку суперкомплексы захватываются в своей нативной форме, можно проводить функциональные анализы. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области митохондриальной биологии к переоценке понимания митохондриальной активности переноса электронов и ее последствий для пациентов с митохондриальными заболеваниями.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ВЭЖХ, масс-спектроскопия, электронная микроскопия или зажим пластыря, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как молекулярный состав, структура или электрофизиологические свойства выделенных белковых комплексов.