Перфузия DiI как метод сосудистой визуализации в Разное

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации сосудистой сети аксолотля. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины о тонкостях реваскуляризации регенерирующих тканей в аксолотле. Основное преимущество этого метода визуализации сосудов заключается в том, что все кровеносные сосуды у животного могут быть легко визуализированы на стандартном флуоресцентном микроскопе.

Хотя этот метод может дать представление о регенерации конечностей аксолотля, он также может быть применен к другим тканям, таким как хвост, сердце, глаза, жабры или другие органы. Перед вскрытием грудной клетки аксолотля сначала подтвердите соответствующий уровень седативного эффекта путем пощипывания пальцев ног. Затем с помощью хирургических щипцов защипните кожу вдоль центральной оси грудной клетки, чуть ниже линии плеч.

С помощью скальпеля сделайте разрез в месте подтягивания кожи и удалите квадратный участок кожи над грудью, чтобы обнажить две хрящевые пластины. Затем откройте окно над грудной полостью и осторожно разорвите соединительную ткань, не разрезая крупные кровеносные сосуды. С помощью щипцов приподнимайте каждую хрящевую пластину по отдельности, иссекая каждую пластину хирургическими ножницами.

Осторожно пережмите обнаженный перикард щипцами. Подтягиваем ткань вверх и прокалываем ее хирургическими ножницами, достаточно глубоко, чтобы удалить перикард без травмирования сердца. Затем аккуратно удалите перикард, чтобы обнажить сердце и аорту, чтобы четко увидеть сердце примерно на пяти миллиметрах от аорты, ответвляющейся от сердца.

Чтобы перфузировать аксолотль, поместите подставку для зажима с заряженной иглой-бабочкой рядом с рамой из пенополистирола таким образом, чтобы рычаг зажима был легко манипулируемым для введения иглы. Включите перистальтический насос, чтобы промыть 0,7x PBS через трубку насоса и направьте кончик иглы в сторону ростральной стороны. Проденьте щипцы под дугу аорты и слегка подтяните вверх.

Затем маневрируйте комбинацией игольчатого зажима так, чтобы игла проходила по длине аорты по направлению к голове животного, и введите иглу примерно на пять миллиметров в аорту, держа щипцы позади аорты для поддержки. Успешное введение может быть подтверждено видимым увеличением предсердий сердца. Быстро разорвите одно предсердие и дайте крови стечь.

Затем профузьте аксолотль примерно 20-30 миллилитрами PBS. После успешной перфузии животное должно измениться со светло-розового на белый цвет. Когда вся PBS будет перфузирована, приостановите работу перистальтического насоса и переместите свободный конец трубки в 15-миллилитровую трубку с раствором Dil.

Перезапустите насос, стараясь не допустить образования пузырей в трубке и перфузии животного со всем рабочим запасом Dil. При успешной перфузии аксолотль изменится на ярко-розовый цвет, который будет наиболее заметен в жабрах. Когда весь дил будет перфузирован, приостановите работу насоса и поместите свободный конец трубки в 4% раствор параформальдегида.

Затем перезапустите насос и профузьте не менее 10 миллилитров фиксатора. Когда весь параформальдегид будет введен, остановите насос и удалите иглу. Переложите аксолотля на пластиковую чашку и поставьте чашку на предметный столик для флуоресцентного микроскопа.

Затем, при выключенном свете, выберите фильтр, который позволяет возбуждать Dil, который излучает красный оранжевый свет. После успешной перфузии пятно Dil видно как красный сигнал поступления во всех тканях аксолотля, включая хвост, конечности, жабры и глаза. После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно быть осторожным, чтобы не порвать основные кровеносные сосуды или сердце при открытии грудной полости, и вводить иглу на одной линии с аортой, чтобы предотвратить сквозные проколы. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как скелетная подготовка, чтобы ответить на дополнительные вопросы. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в биомедицинской области к изучению сосудистой сети различных видов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять перфузию сердца аксолотля с помощью красителя карбоцианина Dil. Не забывайте, что работа с иглами и параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной и что во время выполнения процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты.