Получение везикул плазматических мембран из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для потенциальной заместительной терапии цитоплазмы

Общей целью этой процедуры является введение новой цитоплазменной заместительной терапии в икроножную мышцу мышей с использованием плазматических мембранных везикул, или PMV, полученных из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей или BMSC. Этот метод может помочь ответить на вопросы с дополнением клеток молодой цитоплазмой из других BMSC с помощью слияния PMV, который может улучшить или даже обратить вспять возрастные ассоциативные фенотипы. Основным преимуществом данной методики является то, что PMV инкапсулирует цитозоль BMSC и может быть мгновенно индуцирован путем механической экструзии.

Когда вы демонстрируете этот метод, это имеет решающее значение, поскольку вы выдавливаете и конструируете шаги, которые трудно изучить путем тестирования или фактического владения. Для получения PMV сначала культивируют мышиные BMSC в полной культуральной среде DMEM в одной лунке из шести лунок планшета в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Когда клетки достигнут 90% конфлюенции, промойте лунку 0,5 мл свободного кальция PBS и отделите клетки 0,5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА.

Через три минуты при температуре 37 градусов Цельсия несколько раз постучите по пластине ладонью, чтобы облегчить диссоциацию клеток и остановить пищеварение одним миллилитром питательной среды. Переложите клетки в пятимиллилитровую коническую пробирку для центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в четырех миллилитрах свежей питательной среды. Затем разделите клетки между двумя лунками нового шестилуночного планшета и верните планшет в инкубатор для клеточных культур на 24 часа.

На следующий день соберите клетки из одной лунки с помощью расщепления трипсина, как показано выше. Суспендирование гранулы в 0,5 миллилитрах свежей питательной среды после сбора центрифугированием. Загрузите клетки в инсулиновый шприц объемом в один миллилитр и прикрепите шприц к фильтрующему блоку.

Быстро нажмите на поршень, чтобы продавить ячейки через фильтр, и выбросьте выдавленную среду. Затем загрузите и пропустите через фильтр 0,5 миллилитров дополнительной питательной среды, как показано только что, собирая среду из второй экструзии. Высадите 150 микролитров собранной среды в стеклянную посуду с дном объемом 35 миллилитров и дайте пузырькам отстояться около 10 минут.

Затем подтвердите наличие PMV под инвертированным фазово-контрастным микроскопом, оснащенным ПЗС-камерой, с использованием объектива с 20-кратным увеличением. Чтобы проследить митохондриальную оболочку и мембранный потенциал в PMV, окрашивайте 90%-ную сливающуюся культуру BMSC соответствующим митохондриальным красителем или зондом митохондриального мембранного потенциала соответственно в свежей питательной среде в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Затем трижды промыть клетки 0,5 миллилитрами PBS на одну промывку и собрать клетки путем расщепления трипсина для получения PMV, как только что было продемонстрировано для их визуализации с помощью конфокальной микроскопии.

Чтобы проследить цитоплазматическую локализацию белков PMV, сначала разбавьте два микрограмма суперспиральной плазмидной ДНК для экспрессии EGFP и шесть микролитров катионного реагента для трансфекции в отдельных 0,5 миллилитровых пробирках, содержащих 50 микролитров сывороточного свободного DMEM. Сделайте вихревые пробирки с последующим кратковременным центрифугированием. Затем по капле добавьте реагент для трансфекции в пробирку, содержащую разбавленный раствор ДНК.

Энергично переведите смесь ДНК в течение одной минуты, после чего кратковременно открутите в 10-минутной инкубации при комнатной температуре. Затем подайте 30%-ную конфлюентную культуру BMSC в шестилуночный планшет с двумя миллилитрами свежей питательной среды и добавьте смесь ДНК по каплям в клетки. Через 48 часов после их трансфекции соберите BMSC путем расщепления трипсина и приготовьте PMV, как только что продемонстрировано.

Затем PMV могут быть проанализированы с помощью конфокальной микроскопии с использованием объектива со 100-кратным увеличением масла. Перед введением PMV пометьте культуру BMSC мембранным красителем, окрашивающим флуоресцентные клетки, в одном миллилитре свежей питательной среды при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут и соберите клетки путем расщепления трипсина. Ресуспендируют меченые клетки в 0,5 миллилитрах свежей питательной среды с добавлением одного микрограмма полиэтиленамина и готовят PMV, как показано на рисунке.

Затем концентрируйте PMV методом центрифугирования и ресуспендируйте гранулу в 100 микролитрах свежей питательной среды с легким взболиванием. Затем загрузите клетки в инсулиновый шприц объемом один миллилитр, оснащенный иглой 30 калибра, и продезинфицируйте внешнюю сторону икроножной мышцы мыши, находящейся под наркозом BALB/c, с помощью 75% этанола. Затем медленно вводите весь объем PMV в мышцу и дайте животному восстановиться под тепловой лампой.

Через 12 часов посыпьте мышцу 75% этанолом, раскройте кожу ножницами и соберите всю икроножную мышцу с обоих концов. Промойте мышцу PBS и поместите ее под флуоресцентный микроскоп. Используя линзу объектива с 20-кратным увеличением, удалите нефлуоресцентные кусочки мышечной ткани острым лезвием бритвы и измельчите оставшиеся сильно красные флуоресцирующие кусочки примерно в девять кубических миллиметровых кубиков.

Погрузите каждый кубик в среду с оптимальной температурой резки. Затем погрузите кубики в жидкий азот на пять минут. И храните образцы тканей при температуре минус 20 градусов Цельсия до их анализа.

PMV, полученные из BMSC, как показано, преимущественно демонстрируют размер в диапазоне около трех микрометров в диаметре, что было исследовано при фазово-контрастной микроскопии с использованием объектива 20-кратного увеличения. Трансфекция BMSC с помощью флуоресцентной экспрессионной кассеты в течение 48 часов иллюстрирует цитоплазматическую инкапсуляцию белка EGFP PMV. Кроме того, воздействие флуоресцентного митохондриального красителя показывает, что большая часть PMV содержит митохондрии.

Большинство из них окрашивают положительно на митохондриальную мембрану потенциального красителя, что указывает на функциональность митохондрий. Обработка полиэтиленаминами перед их введением in vivo предотвращает агрегацию PMV во время их центробежной концентрации для удаления клеточных компонентов. Маркировка BMSC мембранным красителем до создания PMV облегчает создание флуоресцентных отслеживаемых PMV.

Действительно, визуализация замороженных участков икроножной мышцы после внутримышечного введения меченых ПМВ указывает на доставку ПМВ в цитоплазму мышечной клетки, вероятно, через эндоцитоз. При попытке проведения процедуры генерации PMV важно не забывать нагружать шприц соответствующим количеством ячеек, чтобы быстро нажать на поршень при промывке клеток через фильтр. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области терапии стволовыми клетками к изучению лечения возрастных заболеваний у мышей.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить ПМВ из БМСК к доставке цитоплазмы в икроножную мышцу мышей.