Метаболизм Glycoengineering, сиаловые кислоты, с помощью N-ацил-изменение Mannosamines

Общая цель этого метода заключается в получении клеток или продуктов клеточного происхождения с модифицированной экспрессией сиаловой кислоты. Поэтому клетки обрабатывают N-ацил-модифицированными маннозаминами, которые метаболизируются до соответствующих сиаловых кислот и впоследствии экспрессируются на поверхности клетки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гликобиологии, такие как влияние гликоконъюгатов на рецептор-лигандные взаимодействия.

Основными преимуществами данной методики являются то, что она проста в применении и чисто цитотоксична. Чтобы продемонстрировать метаболическую гликоинженерию, мы будем использовать N-ацетилманнозамин, который коммерчески доступен. Кроме того, мы продемонстрируем синтез и использование N-пропионила и N-бутаноилманнозамина.

Показано биологическое влияние метаболической гликоинженерии на экспрессию полизиаловой кислоты. Сначала растворите 431,2 миллиграмма гидрохлорида маннозамина в 10 миллилитрах трех миллимолярных растворов метоксида натрия в стеклянной бутылке объемом 15 миллилитров, содержащей мешалку. Остудите смесь на льду до нуля градусов по Цельсию.

Помешивая, медленно добавьте в раствор по каплям 210 микрометров пропионилхлорида. Затем инкубируйте смесь для перемешивания при нуле градусов Цельсия в течение четырех часов. После этого перелейте раствор в пластиковую трубку объемом 50 миллилитров и тонкой иглой проткните от четырех до 8 отверстий в колпачке трубки.

Быстро заморозьте раствор с помощью жидкого азота. Затем лиофилизируйте образец до полного высыхания. После лиофилизации высушенный продукт растворить в этилацетате, метаноле и воде.

С помощью пипетки загрузите раствор на заранее подготовленную силикагелевую колонку. После элюирования 500 миллилитров растворителя соберите четыре миллилитровые фракции. Переложите элюированные фракции в пластиковую трубку объемом 15 миллилитров, а в колпачке трубки тонкой иглой проделайте от трех до шести отверстий

После замораживания раствора жидким азотом лиофилизируйте образец до полного высыхания. Культивирование клеток нейробластомы Келли в среде RPMI при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Перед применением маннозаминов отделите клетки нейробластомы Келли, инкубируя их в течение 10 минут с трипсином и ЭДТА.

После нейтрализации трипсина средой RPMI подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра. Чтобы измерить моносахариды сиаловой кислоты, поместите клетки в 500 микролитров среды в 48-луночный планшет для культуры тканей. Для анализа полизиаловых кислот поместите клетки в трех миллилитрах среды на чашку для клеточных культур диаметром шесть сантиметров.

Добавьте соответствующие производные маннозамина, растворенные в RPMI, к свежепокрытым клеткам в конечной концентрации пять миллимоляров и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, заменяя среду, содержащую N-ацилмодифицированные маннозамины, каждые 24 часа. После обработки сцедите средство и промойте клетки PBS. Отделите клетки, инкубируя их в течение 10 минут с трипсином и ЭДТА.

Нейтрализуйте трипсин, добавив к отделенным клеткам такой же объем среды для культивирования клеток. После этого переложите оторвавшиеся клетки в пластиковые пробирки объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте образцы в течение трех минут при 500-кратном G. После удаления надосадочной жидкости трижды промойте клетки пятью миллилитрами PBS.

После центрифугирования собранные клеточные гранулы ресуспендируют в 500 микролитрах ледяного буфера для лизиса ВЭЖХ. Ультразвуковое исследование образцов с помощью ультразвуковой иглы для обработки данных три раза в течение 30 секунд при средних и высоких амплитудах, охлаждая образцы на льду в течение не менее одной минуты между циклами. После центрифугирования лизированных образцов клеток отделить надосадочную жидкость от мембранных фракций в пластиковых пробирках объемом 1,5 миллилитров.

Для кислотного гидролиза добавьте 150 микролитров одного молярного раствора ТЖК к отделенным мембранным фракциям. Инкубируйте образцы в течение четырех часов при температуре 80 градусов Цельсия с встряхиванием при 200–600 об/мин. Затем транспортируйте образцы в фильтрующие трубки объемом 0,5 миллилитра с тремя килодальтонными мембранами отчуждения.

Центрифугируйте образцы в течение примерно 30 минут при температуре 20 000 G и 21 градусе Цельсия, пока объем верхней фазы не станет менее 20 микролитров. После этого выбросьте вкладыши и тонкой иглой проткните два-четыре отверстия в крышках пробирок, содержащих ультрафильтрат. После замораживания образцов жидким азотом лиофилизируйте их на ночь.

Суспендируйте высушенные образцы в 10 микролитрах 120 миллимолярного раствора ТФК и добавьте 50 микролитров раствора ДМБ. Переложите образцы в темные пробирки объемом 1,5 миллилитра, чтобы защитить их от ультрафиолета. Инкубируйте образцы клеточных мембран и стандарты в течение 1,5 часов при температуре 56 градусов Цельсия.

После инкубации добавьте четыре микролитра 400 миллимолярного раствора гидроксида натрия в каждый образец, чтобы остановить реакцию мечения. Для анализа ВЭЖХ установите температуру колонки на 40 градусов Цельсия и настройте флуоресцентный детектор на 373 нанометра для возбуждения и 448 нанометров для пропускания соответственно. Введите 10 микролитров объема образца и разделите зонды на 15 минут со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту с метанолом, ацетонитрилом и водой в качестве элюанта.

Для масс-спектрометрического анализа необходимо ввести 20 микролитров каждого собранного образца ВЭЖХ в систему масс-селективного детектора LC. В оценочном программном обеспечении системы масс-селективных детекторов LC выберите интересующий пик на общей ионной хроматограмме. Просмотрите массовый спектр разрешенного пика и отобразите положительное отношение массы к заряду в диапазоне от 300 до 700.

Добавьте один миллилитр буфера для лизиса вестерн-блота к заранее приготовленным гранулам гликоинженерных клеток и сделайте вихрь. Инкубируйте образцы в течение 30 минут на льду, совершая вихрь каждые пять минут. После этого центрифугируйте образцы в течение 1,5 часов при температуре 20 000 G и четырех градусах Цельсия.

Затем соберите надосадочную жидкость, содержащую белки, из лизированных клеток в пробирки объемом 1,5 миллилитров. Подготовьте образцы для SDS-страницы, добавив 10 микролитров буфера для образцов Laemmli к 90 микролитрам каждой белковой фракции. Прокипятите образцы в течение пяти минут.

После загрузки образцов в 8%-ный гель SDS-акриламида запустите гель при давлении 25 миллиампер в течение двух часов при комнатной температуре. Когда закончите, осторожно снимите стеклянную крышку с геля и вырежьте верхнюю часть геля, содержащую загрузочные карманы. Далее поместите гель на мембрану из нитроцеллюлозы толщиной 0,2 микрометра, предварительно смоченную в буфере вестерн-блот.

Перенесите белки в нитроцеллюлозу в соответствии с рекомендацией системы. После удаления нитроцеллюлозной мембраны из блоттинговой системы окрасьте кляксу красным цветом Понсо, чтобы визуализировать белки и тем самым контролировать качество переноса. Затем перенесите нитроцеллюлозную мембрану в пластиковую камеру и добавьте 10 миллилитров блокирующего раствора.

После инкубации нитроцеллюлозной мембраны сцедите блокирующий раствор и добавьте моноклональное антитело к полизиаловой кислоте 735 в PBS. После инкубации промывайте мембрану не менее трех раз в течение пяти минут PBS. Теперь добавьте поликлональное вторичное антитело против мышиного IgG, связанное с пероксидазой хрена, к мембране нитроцеллюлозы.

После инкубации и промывки мембраны перенесите ее на тарелку соответствующего тепловизора. Затем определите сигнал в соответствии с инструкциями производителя. ДМБ меченая N-гликолилнейраминовая кислота, элюирует от семи до девяти минут.

Кроме того, меченная DMB N-ацетилнейраминовая кислота элюируется от 10 до 12 минут. Несколько меньших пиков, наблюдаемых на хроматограмме, представляют собой непрореагировавшие ДМБ и промежуточные реакционные соединения. Хроматограммы клеточных лизатов ВЭЖХ показывают несколько неопределенных пиков, которые представляют собой внутренние примеси и побочные продукты ДМБ от реакции с другими альфа-кетокислотами, присутствующими в клеточных лизатах.

Лечение N-ацетилманнозамином часто приводит к истощению N-гликолилнейраминовой кислоты на поверхности клеток. На хроматограммах лизированных клеток, обработанных N-пропионилнейраминовой кислотой или N-бутаноилнейраминовой кислотой, наблюдаются пики, свидетельствующие о появлении соответствующих неприродных сиаловых кислот. Реакция ДМБ с формами сиаловой кислоты приводит к увеличению молекулярной массы на 116,2 дальтона, по сравнению с формами сиаловой кислоты, которые не мечены этим красителем.

Помимо потенцированных ионных форм, наблюдаются также аддуктовы натрия. DMB-Neu5Gc элюирует вскоре после непрореагировавших или частично прореагировавших форм DMB, что объясняет появление неопределенных пиков в масс-спектре DMB-Neu5Gc. Лечение клеток нейробластомы Келли N-пропионилманнозамином или N-бутаноилманнозамином приводит к снижению экспрессии полизиатической кислоты на поверхности клетки.

Лечение N-ацетилманнозамином, с другой стороны, приводит к увеличению экспрессии полизиатической кислоты. Применяя эту методику, клетки с полным сиалированием могут быть сгенерированы в течение нескольких дней. Такие гликоинженерные клетки могут быть использованы в дальнейших экспериментах.

Например, для изучения рецептор-лигандных взаимодействий или, как показано здесь, для ингибирования экспрессии полизиатовой кислоты. Представленная здесь методика метаболической инженерии оптимизирована для экспериментов с сиаловой кислотой. Тем не менее, та же процедура может быть использована и в экспериментах на животных.

Мы надеемся, что представленный нами протокол и это видео помогут авторам внедрить метаболическую гликоинженерию в лаборатории для анализа функции, а также биологической роли сиаловой кислоты и рецепторов сиаловой кислоты в биологических системах. Химики-органики могли бы синтезировать N-ацил-модифицированные маннозамины с более сложными структурами и использовать их так, как это предлагается в нашем протоколе. В соответствии с нашим протоколом, все образцы должны быть проанализированы сразу после флуоресцентного мечения.

Следовательно, не должно быть задержки между анализаторами ВЭЖХ и СКУД.