Обнаружение эстрогенных лигандов в продуктах личной внимательности с использованием дрожжей эстроген экран оптимизирован для лаборатории обучения студентов

Общая цель данной процедуры заключается в использовании дрожжевого эстрогенного скрининга для количественного определения агонистов рецепторов эстрогена человека, экстрагированных из средств личной гигиены. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области токсикологии, эндокринных нарушений и экофизиологии, поскольку он позволяет обнаруживать и количественно определять содержание экологических эстрогенов в воде, пищевых продуктах и средствах личной гигиены. Основными преимуществами данного метода in vitro являются его доступность, широкое применение, а также то, что он служит отличной базой для обучения техническим лабораторным навыкам.

Обнаружение эстрогенов в окружающей среде имеет критическое значение, поскольку они могут изменять гормональную сигнализацию, особенно в период развития плода и в периоды физиологической перестройки, такие как половое созревание. Наиболее сложными этапами данного метода являются расчеты и анализ данных, которые мы упростили, разработав удобное в использовании приложение. Также крайне важно обеспечить точность дозирования при пипетировании.

Данный протокол начинается с приготовления реагентов. Приготовьте среды с глюкозой и галактозой, контрольные образцы растворителя (50% ethanol), а также стандарты эстрадиола, которые будут использоваться в первый день анализа, а также буфер LacZ, дитиотреитол и карбонат натрия для второго дня. Стерилизуйте среды с глюкозой и галактозой путем фильтрации через фильтр 0.2 micrometer.

На одном 96-луночном планшете можно протестировать в трех повторностях до 23 различных средств личной гигиены (PCP) и контролей экстракции. К средствам личной гигиены относятся мыло, крем для волос, шампунь, солнцезащитный крем, косметика, крем для бритья и лосьон. Для целей съемки образцы будут подготовлены только из восьми видов средств личной гигиены.

Смешайте один грамм каждого образца с 10 миллилитрами безводного этанола в конической пробирке объемом 15 миллилитров. Кроме того, подготовьте отрицательный контрольный образец экстракции, состоящий из 11 миллилитров безводного этанола в конической пробирке объемом 15 миллилитров. Гомогенизируйте содержимое каждой конической пробирки в течение 30 минут, сочетая ручное встряхивание и вортексирование.

Центрифугируйте конические пробирки на максимально допустимой скорости в навесной центрифуге в течение 10 минут. Слейте супернатант из каждой пробирки через клеточный фильтр с порами 40 µm в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем перенесите содержимое каждой пробирки объемом 50 мл в стеклянный флакон для сцинтилляционного счета.

Дайте этанолу полностью испариться, оставив флаконы открытыми в вытяжном шкафу на одну неделю. Берегите высушиваемыми образцы от света, чтобы избежать деградации светочувствительных компонентов. После высыхания образцов восстановите каждый из них в одном миллилитре 50% ethanol, затем перемешайте на вортексе для гомогенизации.

За две ночи или примерно за 42 часа до приготовления планшетов для дрожжевого эстрогенного скрининга (YES), используя стерильную технику, проведите субкультивирование дрожжей, добавив по 0,1 мл каждой активной культуры дрожжей в 10 мл фильтр-стерилизованной глюкозной среды в стерильной колбе Эрленмейера. Инкубируйте при 30 °C, продолжая инкубировать исходные культуры в качестве стоковых. Спустя два дня, в первый день проведения YES-анализа, используя стерильную технику, разведите суспендированные культуры дрожжей и фильтр-стерилизованную галактозную среду в стерильном стакане.

Подтвердите оптическую плотность, перенеся по 120 µL каждой пробы дрожжей в трех повторностях, а также холостые пробы среды с галактозой в трех повторностях, в прозрачный полистирольный планшет. Используйте планшетный спектрофотометр, чтобы убедиться, что разведенная культура дрожжей имеет чистую оптическую плотность 0,065 ± 0,005 при длине волны 610 нм. Определите чистую OD610 дрожжей, вычтя OD610 холостых проб среды с галактозой.

Используя репитирующий дозатор со стерильным наконечником-шприцем, внесите разведенную суспензию дрожжей в лунки стерильного полипропиленового 96-луночного микропланшета в соответствии со схемой расположения. Во время дозирования поддерживайте суспензию дрожжей в исходном стакане путем постоянного перемешивания стакана или перемешивания с помощью дозатора. В завершение добавьте 120 µL фильтр-стерилизованной галактозной среды в лунки с H10 по H12, отмеченные зеленым цветом на схеме планшета, чтобы они служили контролями среды для учета поглощения, обусловленного самой средой.

Подготовьте отдельные планшеты для каждой комбинации штамма дрожжей и колориметрического субстрата, которые будут протестированы. Затем постройте стандартную кривую в каждом планшете методом серийных разведений в соответствии со схемой планшета. Используя одноканальный дозатор со стерильными наконечниками, внесите 5 µL стандарта эстрадиола в лунки A1, A2 и A3. Используйте многоканальный дозатор для перемешивания содержимого лунок путем пипетирования, после чего перенесите 205 µL из лунок A1–A3 в лунки B1–B3. Повторяйте перенос 205 µL до ряда G. После завершения серийных разведений удалите 205 µL из лунок G1–G3. По окончании этого этапа во всех лунках со стандартами должно остаться 120 µL.

Добавьте 5 µL 50% этанола в каждую лунку с контролем растворителя, содержащую суспензию дрожжей (лунки H1, H2 и H3), которые отмечены синим цветом на схеме планшета. Следующим шагом является добавление образцов или отрицательных контролей экстракции в трехкратном повторе объемом 5 µL в лунки, содержащие суспензию дрожжей, которые отмечены фиолетовым цветом на схеме планшета. Отметьте, какие образцы или контроли экстракции помещены в соответствующие лунки.

Чтобы отслеживать, в каких лунках находятся образцы, а в каких нет, начните с новой коробки наконечников и используйте наконечники из тех же позиций в коробке, что и соответствующие позиции лунок в планшете. Перемешайте содержимое лунок с образцом, контролем экстракции и контролем растворителя путем пипетирования. Доведите объем в этих лунках до 120 microliters, удалив из каждой 205 microliters.

Герметично закройте каждый планшет стерильной адгезивной пористой пленкой, промаркируйте и инкубируйте при 30 °C в течение 17 часов. По истечении 17-часовой инкубации извлеките планшеты из инкубатора. Если планшеты невозможно обработать немедленно, оберните их пищевой пленкой и храните в холодильнике при 4 °C до шести дней.

Когда наступит время обработки планшетов, разверните их. С помощью многоканального дозатора перемешайте содержимое каждой строки лунок, затем перенесите 50 µL суспензии дрожжей из каждой лунки в соответствующую лунку прозрачного полистиролового 96-луночного микропланшета. Маркируйте новый планшет.

Чтобы избежать перекрестного загрязнения лунок, используйте новые наконечники для пипетки для каждой лунки, при этом наконечники не обязательно должны быть стерильными. В вытяжном шкафу добавьте 20 µL 1 M DTT к 20 mL размороженного буфера LacZ комнатной температуры до конечной концентрации 1 mM DTT. Тщательно перемешайте буфер LacZ.

С помощью многоразового дозатора внесите 200 µL буфера LacZ, содержащего DTT и либо ONPG, либо CPRG, во все лунки полистирольной планшета, и немедленно измерьте и запишите оптическую плотность всех лунок при 610 нм с помощью планшетного ридера. Повторите процедуру для дополнительных планшетов при необходимости. Закройте планшеты крышками и инкубируйте их при 30 °C в течение указанного времени.

По завершении инкубации извлеките планшеты из инкубатора. С помощью повторяющегося дозатора добавьте по 100 µL карбоната натрия в каждую лунку, чтобы остановить реакцию бета-галактозидазы. Измерьте и запишите оптическую плотность всех лунок при 405 нм для ONPG или при 574 нм для CPRG с помощью планшетного спектрофотометра.

Расчет значений LacZ можно выполнить с помощью автоматизированного приложения, для работы которого требуется установленный Java. Для начала откройте автоматизированное приложение LacZ, описанное в приложении один. Вставьте значения оптической плотности при 405 нм для ONPG или 574 нм для CPRG для всех лунок, используя схему расположения планшета, идентичную той, что показана на рисунке один.

Введите время инкубации в часах, необходимое для развития окраски в анализе, и нажмите «Next». Вставьте значения оптической плотности при 610 нм для всех лунок. Нажмите «Submit», чтобы отобразить результаты LacZ.

Результаты LacZ можно скопировать с помощью команд клавиатуры и вставить в электронную таблицу или другие файлы по мере необходимости. Начните анализ, открыв онлайн-приложение для анализа данных анализа YES. Загрузите CSV-файл с данными, отформатированный согласно описанию на первой вкладке.

Оцифруйте стандартную кривую эстрадиола на второй вкладке и оцените параметры регрессии. Ознакомьтесь с результатами регрессионной модели на третьей вкладке, а затем определите интерполированные значения по оси x, соответствующие значениям LacZ образцов, на четвертой вкладке. Перейдите на пятую вкладку, чтобы увидеть значения эквивалента эстрогена или EEQ для образцов.

Наконец, приведите значения EEQ к исходной массе образца, как описано в текстовом протоколе. Представлены примеры стандартных кривых после 17-часовой инкубации дрожжей с 17-бета-эстрадиолом. По причинам, обсуждаемым в рукописи, CPRG зачастую является более подходящим выбором субстрата, чем ONPG.

В соответствии с предыдущими наблюдениями, анализы с использованием дрожжей, экспрессирующих ER Beta, оказались более чем на порядок более чувствительными, чем анализы с использованием дрожжей, экспрессирующих ER Alpha. Следовательно, эстрогенная активность чаще обнаруживалась в дрожжах, экспрессирующих ER Beta. Дополнительной целью исследования было протестировать длительность инкубации, совместимую с графиком лабораторного курса для студентов бакалавриата.

После введения шестидневного периода охлаждения после 17-часовой инкубации стандартные кривые для охлажденных планшетов оказались сопоставимы с кривыми для неохлажденных планшетов. Стандартные ошибки параметров, рассчитанных с использованием четырехпараметрических логистических регрессионных моделей, были во всех случаях меньше для охлажденных планшетов, чем для неохлажденных. Таким образом, охлаждение планшетов в течение шести дней снижает погрешность и повышает точность оценок EEQ.

После освоения данную методику можно выполнить за два сеанса продолжительностью от трех до четырех часов каждый. При выполнении процедуры важно помнить о необходимости соблюдения правил стерильности на всех этапах, предшествующих 17-часовой инкубации, аккуратно и точно дозировать жидкости с помощью пипетки, а также придерживаться схемы расположения лунок на планшете, представленной на рисунке 1. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как анализы in-vivo на животных, для изучения дополнительных механизмов эстрогенного действия и эффектов на уровне всего организма.

После своей разработки дрожжевой эстрогенный тест стал общепризнанным недорогим методом определения эстрогенных лигандов в объектах окружающей среды, таких как пищевые продукты, ткани растений и средства личной гигиены. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как проводить простую экстракцию средств личной гигиены, культивировать дрожжи, подготавливать стандартные кривые разведения, проводить YES-анализ в 96-луночном планшете и выполнять соответствующие расчеты. И не забывайте, что работа с эстрадиолом может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и других средств индивидуальной защиты, а также обеспечение надлежащей утилизации отходов.