В пробирке Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека в функциональных клетки Cardiomyocyte как

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы индуцировать и наблюдать за кардиомиогенной индукцией мезенхимальных стволовых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мезенхимальных стволовых клеток, такие как какие лекарства могут быть вызваны сигналами окружающей среды для генерации функциональных кардиомиоцитов. Основным преимуществом этой методики является то, что она применяет агрегатное образование и сердечные фетальные слои, а не фармакологические средства или генетический материал.

Применение этого метода распространяется и на терапию сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку он подробно изучает кардиомиогенный потенциал мезенхимальных стволовых клеток. Вместе со мной эту процедуру будут демонстрировать мисс Фарва Икбал, аспирант нашей лаборатории, Макс Либрах и Надав Гаснер, оба стажеры нашей лаборатории. После выделения частей крысиного щенка согласно текстовому протоколу, разрежьте желудочки пополам и переложите их в 10-сантиметровую миску с 10 миллилитрами PBS и нанесите тонкой полоской на лед, чтобы кровь вымылась.

Затем с помощью изогнутых ножниц разрежьте стенки желудочка на небольшие кусочки диаметром два-три миллиметра. С помощью серологической пипетки переложите кусочки сердца от 10 до 12 животных в 50-миллилитровую трубку и дайте им отстояться. Удалите как можно больше PBS P/S, не удаляя сердечники.

Затем добавьте 10 миллиметров свежего PBS P/S. Чтобы изолировать кардиомиоциты, после того как сердечные части осядут, используйте 0,15% трипсина в PBS, чтобы заменить PBS P/S и инкубируйте ткань при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.

Затем повторите расщепление трипсина еще три раза, за исключением того, что декантерные надосадочные жидкости в 50 миллилитровых пробирках для сбора, содержащих 10 миллилитров 100% FBS. Далее центрифугируют пробирки клеток и аспирируют надосадочную жидкость. Затем используйте DMEM-F12 с 10% FBS и 1% P/S для ресуспендирования клеток и засейте их на шестилуночный планшет.

Как только клетки прикрепятся, замените среду двумя миллилитрами свежей среды. Чтобы приготовить предварительно окрашенные МСК, удалите среду из культур МСК, достигших 70-80% конфлюенции в 10-сантиметровой посуде, и добавьте три миллилитра раствора для диссоциации клеток. Выдерживайте посуду при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение пяти минут.

Перенесите диссоциированные клетки в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при температуре 400 x G в течение пяти минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу, и повторно суспендируйте клетки. Затем используйте автоматический счетчик ячеек для подсчета ячеек.

Разбавьте клетки до концентрации от 1 x 10 до шестой МСК на миллилитр, в DMEM-F12, содержащем 10% FBS и 1% P/S. Затем к клеткам в центрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитра добавьте жизнеспособный, непереносимый флуоресцентный краситель и инкубируйте МСК в течение получаса. После центрифугирования пробирок при давлении 400 x G в течение пяти минут отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в концентрации от 1 x 10 до шестой МСК на миллилитр.

Затем перенесите МСК на кардиомиоциты в концентрации 10 х 10 на четвертую клетку на лунку шестилуночного планшета. Для получения агрегатных кокультур приготовьте одноклеточную суспензию МСК в альфа-МЕМ, дополненную 10% FBS и 1% P/S. Инициируйте образование агрегата, поместив 25 микролитров капель клеточной суспензии на внутреннюю поверхность крышек 10-сантиметровых чашек для культивирования тканей.

Поместите крышки на их нижние аналоги, содержащие PBS P/S. Инкубируйте посуду при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Под стереомикроскопом наблюдайте за образованием агрегатов в каплях через три дня.

Если более 80% капель содержали образовавшиеся агрегаты, используйте микропипетку объемом в один миллилитр, чтобы собрать капли с крышек и перенести агрегаты непосредственно на первичные монослои кардиомиоцитов крыс. Инкубируйте агрегатные сокультуры в течение двух недель. Смена полного объема носителя каждые 72 часа.

Ежедневно используйте светлопольную микроскопию для наблюдения за агрегатами, прикрепляющимися к слоям клеток плода. Записывайте сжатые агрегаты при наблюдении. Активные агрегаты сокращаются синхронизированным образом, мы предполагаем проводимость между ними по всему слою плода, который не имеет физической активности.

Отсадите среду и добавьте два миллилитра PBS на лунку из шести лунок. Затем удалите PBS и добавьте два миллилитра диссоциационного раствора на лунку. Инкубируйте посуду при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех минут.

Как показано здесь, HMSC трех различных типов демонстрировали схожее изобилие и внешний вид в прямых сокультурах. Через два-три дня после переноса висячих капель на клетки сердца в агрегированных кокультурах, FTM и term-huck PBC появлялись в более крупных агрегатах по сравнению с теми, которые наблюдались при использовании BMSC. В этом эксперименте проточный цитометрический анализ экспрессии CD49F в недифференцированных МСК показал, что 96% FTM huck PBC, называемых 89% huck PBC и 53% BMSC, были положительными на CD49F на клеточной поверхности.

Проточная цитометрия на TRA выиграла 85 клеток, показала повышение регуляции маркера, ассоциированного с кардиомиоцитами, SIRPA в FTM huck PBC и term huck PBC, но не в BMSC из прямых кокультур кардиомиоцитов. Как видно на рисунке, апрегуляция cx43 была значительно выше в FTM huck PBC по сравнению с терминами huck PBC или BMSC в прямых кокультурах. Анализ флуоресцентной микроскопии показал, что дифференциация FTM и term huck PBC, оба активизируют cx43.

С термином huck PBC в большей доле, чем FTM. Тем не менее, флуоресцентная микроскопия показала, что cx43 положительные точки наблюдались в клеточной мембране FTM huck PBC, и они были преимущественно цитоплазматическими в доношенных клетках. Наконец, как видно на рисунке, флуоресцентная микроскопия с большим увеличением была выполнена на отсортированных клетках человека после совместного культивирования и подтверждения высокого содержания cx43 в плазматической мембране.

После освоения ключевые этапы этой процедуры можно выполнить за один час каждый, если они выполнены правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно соблюдать асептические меры предосторожности. Вовлечены первичные ткани животных, которые могут привести к загрязнению при неправильном обращении.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как дальнейшая культивирование сжимающихся заполнителей, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как долговечность этих структур. После его разработки этот метод позволяет исследователям в области МСК исследовать потенциал дифференцировки более молодых источников мезенхимальных стволовых клеток, таких как экстраэмбриональные ткани. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить агрегаты МСК и комбинировать их с прямыми первичными тканевыми слоями плода таким образом, чтобы обеспечить надлежащую индукцию для кардиомиогенной дифференцировки.

Не забывайте, что работа с BRDU может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как правильное обращение с цитотоксическими отходами.