Эффекты аллогенной тромбоцитов богатые плазмы (PRP) на процесс заживления секционного ахиллова сухожилия крыс: методологическое описание

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за влиянием однократной инъекции обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) на резистентность и процесс заживления хирургически разрезанных ахилловых сухожилий крысы в различные моменты времени. Этот метод может помочь ответить на быстрые вопросы о поражениях сухожилий в опорно-двигательном аппарате. Основное преимущество этой методики заключается в том, что хирургические, биомеханические процедуры и процедуры прогрессирования PRP хорошо стандартизированы.

Последствия этих методов распространяются и на использование PRP у людей, потому что эти типы поражений и процесс заживления сухожилий схожи у крыс и человека. Хотя этот метод может дать представление о подготовке PRP при травмах опорно-двигательного аппарата, эта техника инъекций также может быть применена к другим системам, таким как сердечные или кожные заболевания. Визуальная демонстрация метода очень важна, потому что хирургические и биомеханические этапы требуют последовательной воспроизводимости для получения оптимальных результатов.

Начните с взвешивания и бирки для ушей крысы. После подтверждения соответствующего уровня седативного эффекта путем щипкования пальцев ног нанесите капли воды на роговицу животного и удалите шерсть с левой задней конечности. Продезинфицируйте открытые участки кожи с помощью разведения изо-бетадина в соотношении один к 10 и положите животное на грелку с температурой 20 градусов Цельсия под препарирующим микроскопом в боковом положении пролежня, при этом левая задняя конечность находится в верхнем положении.

Возьмитесь щипцами за лапу левой задней конечности и сделайте боковой разрез кожи от 20 до 25 миллиметров вокруг ахиллова сухожилия. С помощью тонких ножниц рассеките фасцию, чтобы обнажить комплекс ахиллова сухожилия и удалить подошвенное сухожилие. Разрежьте ахиллово сухожилие поперечно, на пять миллиметров проксимальнее его пяточного введения, и удалите часть длиной пять миллиметров.

Затем используйте рассасывающуюся пряжу и продолжайте накладывать швы, чтобы закрыть фасцию и кожу, и поместите крысу под источник тепла с мониторингом до полного восстановления. Пока животные-реципиенты выздоравливают, соберите 20 миллилитров цельной крови от одного донорского сердца крысы на каждое подопытное животное в отдельные пробирки, содержащие 3,2% буферизованного цитрата натрия. Чтобы получить обогащенную тромбоцитами плазму, центрифугируйте кровь и с помощью пластиковой передаточной пипетки осторожно собирайте верхнюю фазу, содержащую PRP, во вторую пластиковую пробирку.

Определите объем собранного PRP и измерьте количество тромбоцитов на гематологическом анализаторе. Снова центрифугируйте PRP и осторожно переложите надосадочную жидкость в новую пластиковую пробирку. Оставшийся объем в пробирке PRP должен составлять около 2/3 объема, необходимого для достижения 2,5 умножить на 10 до шестой части тромбоцитов на микролитр.

Далее аккуратно повторно суспендируйте тромбоцитарную гранулу с помощью пипетирования. Измерьте количество тромбоцитов в этой концентрированной обогащенной тромбоцитами плазме, добавив обратно соответствующий объем аутологичной бедной тромбоцитами плазмы для достижения целевой концентрации по мере необходимости. Активируйте тромбоциты с помощью 50 микролитров хлорида кальция на миллилитр PRP в течение примерно одного часа при комнатной температуре.

Затем загрузите тромбоциты в одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 21-го калибра, и введите 50 микролитров тромбоцитов непосредственно в место наложения швов каждого животного. В соответствующей экспериментальной конечной точке обрить левую заднюю конечность подопытного животного, находящегося под наркозом, и поместить крысу под препарирующий микроскоп, как показано выше. Придерживая лапу пальцами, сделайте 10-миллиметровый разрез в месте операции, чтобы обнажить трицепс суралис.

Чтобы удалить ахиллово сухожилие, разрежьте пяточную кость поперечно, на 5-10 миллиметров дистальнее ее прикрепления, и рассеките часть трицепса достаточно большую, чтобы поместиться в криочелюсть. С помощью щипцов поместите образец непосредственно в верхнюю челюсть криочелюсти и закройте инструмент. Поместите криочелюсть вертикально в универсальную испытательную машину, а пяточную кость зафиксируйте между нижними зажимами.

Чтобы рассчитать площадь поперечного сечения, разместите камеры перпендикулярно друг другу. Добавьте жидкий азот в оба бассейна верхней челюсти, чтобы заморозить мышцу на порядок жестче сухожилия, чтобы она не деформировалась во время испытания на растяжение. Когда зона замерзания достигнет границы металлического зажима, установите скорость перемещения машины с постоянной скоростью один миллиметр в секунду до разрыва и начните испытание на разрыв, используя компьютер для записи предела прочности на разрыв в ньютонах.

Чтобы учесть различия в площадях поперечного сечения заживающих сухожилий, нормализуйте предел прочности на разрыв до единицы площади, которая представляет механическое напряжение, испытываемое тканью. Затем, когда сухожилие разрывается, SNAP замораживают образцы разорванных сухожилий в жидком азоте и хранят их при температуре минус 80 градусов Цельсия до экстракции РНК и анализа RTPCR. В этом репрезентативном эксперименте требовалась большая сила, чтобы вызвать разрыв сухожилия в группе, получавшей PRP-инъекцию, чем в контрольной группе, получавшей физиологический раствор, в каждый момент тестирования, что свидетельствует о более надежном процессе заживления или лучших механических свойствах у животных, получавших PRP.

Несмотря на то, что в группе PRP наблюдался более высокий внутригрупповой разброс, чем в группе с солевым раствором, было установлено, что площадь поперечного сечения сухожилий была больше в группе, получавшей PRP-инъекцию, на 15-й и 30-й день после индукции поражения. Кроме того, трихромное окрашивание Массона выявило более высокое присутствие фибриллярного коллагена, ключевого компонента морфологии и прочности сухожилий, у животных, получавших PRP, на 5-й и 15-й дни, с аналогичной интенсивностью окрашивания, наблюдаемой в обеих группах на 30-й день после инъекции. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как вызвать у крысы стандартные поражения, а также взять образцы сухожилий, чтобы оценить процесс их заживления после инъекции PRP.