Эффекты аллогенной тромбоцитов богатые плазмы (PRP) на процесс заживления секционного ахиллова сухожилия крыс: методологическое описание
19 марта 2018 г.
Этот протокол описывает процесс оценки исцеления сухожилия в крыс, которые были введены с аллогенной тромбоцитов богатой плазмы (PRP) или физиологический раствор после удаления части ахиллова сухожилия. Ход лечения сухожилия оценивается в нескольких точках времени, с использованием различных видов анализа.
Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении за влиянием однократной инъекции обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) на сопротивление и процесс заживления хирургически пересеченных ахилловых сухожилий крыс в различные временные интервалы. Этот метод позволяет оперативно решать вопросы в области опорно-двигательного аппарата, касающиеся повреждений сухожилий. Основным преимуществом данной методики является высокая степень стандартизации хирургических, биомеханических процедур и этапов введения PRP.
Значение этих методов распространяется на использование PRP у людей, поскольку данные типы повреждений и процесс заживления сухожилий у крыс и человека схожи. Хотя этот метод позволяет получить представление о подготовке PRP при скелетно-мышечных повреждениях, данная техника инъекций может быть применена и к другим системам, например, при заболеваниях сердца или кожи. Визуальная демонстрация метода крайне важна, так как хирургические и биомеханические этапы требуют строгого воспроизведения для достижения оптимальных результатов.
Начните с взвешивания крысы и установки ушной метки. После подтверждения надлежащего уровня седации с помощью щипкового теста (сжатия пальца) закапайте воду на роговицы глаз животного и удалите шерсть с левой задней конечности. Дезинфицируйте открытый участок кожи раствором iso-Betadine в разведении 1:10, затем поместите животное на heating pad с температурой 20 °C под диссекционный микроскоп в положении лежа на боку, بحيث левая задняя конечность находилась бы сверху.
Захватите стопу левой задней конечности пинцетом и сделайте латеральный разрез кожи длиной от 20 до 25 миллиметров вокруг ахиллова сухожилия. С помощью тонких ножниц рассечьте фасцию, чтобы обнажить комплекс ахиллова сухожилия, и удалите сухожилие plantarиса. Перережьте ахиллово сухожилие поперечно на 5 миллиметров проксимальнее места его прикрепления к пяточной кости и удалите фрагмент длиной 5 миллиметров.
Затем с помощью рассасывающейся нити наложите швы для закрытия фасции и кожи, после чего поместите крысу под источник тепла под наблюдение до полного восстановления. Пока животные-реципиенты восстанавливаются, соберите по 20 миллилитров цельной крови из сердца одной крысы-донора для каждого экспериментального животного в отдельные пробирки, содержащие 3,2% буферизированный цитрат натрия. Чтобы получить богатую тромбоцитами плазму, центрифугируйте кровь и с помощью пластической переносной пипетки осторожно соберите верхнюю фазу, содержащую PRP, во вторую пластиковую пробирку.
Определите объем собранной PRP и измерьте количество тромбоцитов на гематологическом анализаторе. Снова центрифугируйте PRP и осторожно перенесите супернатант в новую пластиковую пробирку. Оставшийся объем в пробирке с PRP должен составлять примерно 2/3 от объема, необходимого для достижения концентрации 2,5 × 10⁶ тромбоцитов на мкл.
Затем осторожно ресуспендируйте осадок тромбоцитов с помощью пипетирования. Измерьте количество тромбоцитов в этой концентрированной тромбоцитарной плазме, при необходимости добавив соответствующий объем аутологичной обедненной тромбоцитами плазмы для достижения целевой концентрации. Активируйте тромбоциты, добавив 50 µL хлорида кальция на 1 mL PRP, и выдержите около одного часа при комнатной температуре.
Затем перенесите тромбоциты в шприц объемом 1 мл, оснащенный иглой 21G, и введите 50 µL тромбоцитов непосредственно в место наложения шва каждому животному. По достижении соответствующей конечной точки эксперимента выбрейте шерсть на левой задней конечности анестезированного подопытного животного и поместите крысу под диссекционный микроскоп, как было показано ранее. Удерживая лапу пальцами, сделайте разрез длиной 10 мм в области хирургического вмешательства, чтобы обнажить трехглавую мышцу голени (triceps suralis).
Для извлечения ахиллова сухожилия произведите поперечный разрез пяточной кости на расстоянии 5–10 мм дистальнее места прикрепления и выделите фрагмент трехглавой мышцы голени достаточного размера, чтобы он поместился в криозажимы. С помощью пинцета немедленно поместите образец в верхние губки криозажимов и закройте инструмент. Установите криозажимы вертикально в универсальную испытательную машину и зафиксируйте пяточную кость в нижних зажимах.
Для расчета площади поперечного сечения расположите камеры перпендикулярно друг другу. Добавьте жидкий азот в оба резервуара верхней челюсти, чтобы заморозить мышцу до состояния, когда она станет на порядок жестче сухожилия, чтобы предотвратить ее деформацию во время испытания на растяжение. Когда зона замораживания достигнет границы металлического зажима, установите скорость смещения установки на постоянную величину 1 мм/с до момента разрыва и начните испытание на растяжение, используя компьютер для записи предела прочности при растяжении в Newtons.
Чтобы учесть различия в площади поперечного сечения заживающих сухожилий, нормируйте предельную прочность на разрыв по единице площади, что представляет собой механическое напряжение, воздействующее на ткань. После разрыва сухожилия подвергните образцы мгновенной заморозке в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C до проведения экстракции РНК и анализа методом ОТ-ПЦР. В данном репрезентативном эксперименте для разрыва сухожилия в группе с инъекциями PRP во всех протестированных временных точках требовалась большая сила, чем в контрольной группе, получавшей физиологический раствор, что свидетельствует о более интенсивном процессе заживления или лучших механических свойствах тканей у животных, получавших PRP.
Хотя в группе PRP наблюдался более высокий внутригрупповой разброс показателей, чем в группе с физиологическим раствором, было установлено, что площадь поперечного сечения сухожилий была больше в группе с инъекциями PRP на 15-й и 30-й дни после создания повреждения. Кроме того, окрашивание трихромом по Массону выявило большее содержание фибриллярного коллагена, ключевого компонента морфологии и прочности сухожилий, у животных, получавших PRP, на 5-й и 15-й дни, при этом к 30-му дню после инъекции интенсивность окрашивания в обеих группах была схожей. После просмотра этого видео вы должны хорошо усвоить, как создавать стандартные повреждения у крыс и как отбирать образцы сухожилий для оценки процесса их заживления после инъекции PRP.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается оценка заживления сухожилий у крыс, которым после операции на ахилловом сухожилии вводили обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) или физиологический раствор. Процесс заживления оценивается в различные моменты времени с использованием стандартизированных методов анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Исследования опорно-двигательного аппарата
Теоретические сведения
- Богатая тромбоцитами плазма (PRP) используется для ускорения заживления при повреждениях опорно-двигательного аппарата.
- Исследование сосредоточено на сходстве процессов заживления сухожилий у крыс и людей.
- Стандартизированные хирургические и биомеханические процедуры имеют решающее значение для воспроизводимости результатов.
- Полученные данные могут быть использованы для применения PRP в различных областях медицины.
Цель исследования
- Изучить влияние PRP на заживление хирургически пересеченных ахилловых сухожилий крыс.
- Предложить метод оценки повреждений сухожилий в контролируемых условиях.
- Исследовать возможности применения терапии PRP при повреждениях сухожилий у людей.
Используемые методы
- Инъекции PRP или физиологического раствора в ахилловы сухожилия крыс.
- Оценка заживления сухожилия в нескольких временных точках.
- Стандартизированные хирургические процедуры для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Биомеханический анализ для оценки прочности и заживления сухожилия.
Основные результаты
- Лечение PRP оказало значительное влияние на заживление сухожилия по сравнению с физиологическим раствором.
- Стандартизированные методы позволили надежно оценить прогресс заживления.
- Результаты могут быть использованы при дальнейшем применении PRP в медицине человека.
- Визуальная демонстрация метода позволила лучше понять ход процедуры.
Выводы
- PRP является перспективным методом лечения для ускорения заживления сухожилий.
- Полученные результаты подтверждают целесообразность использования животных моделей для изучения повреждений сухожилий у человека.
- Стандартизированные протоколы необходимы для получения воспроизводимых результатов.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Данный протокол представляет собой стандартизированный метод оценки заживления сухожилий на доклинической модели грызунов, что позволяет снизить механистические риски при разработке терапии на основе богатой тромбоцитами плазмы (PRP) для лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата. Путем количественного определения биомеханической прочности, отложения коллагена и транскриптомных изменений в нескольких временных точках данный подход обеспечивает валидацию мишеней и прогностическую уверенность на ранних этапах поиска. Воспроизводимая модель хирургического повреждения и рабочий процесс приготовления PRP способствуют межфункциональному взаимодействию между группами фундаментальной биологии и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать биологическое воздействие PRP на пути восстановления сухожилий посредством контролируемого индуцирования повреждения и своевременного забора тканей.
- Операционная ценность: стандартизированные хирургические процедуры и методы инъекций снижают вариабельность, что способствует надежной оценке взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: биомеханические и гистологические показатели обеспечивают количественные метрики для функциональной валидации мишени и принятия решений о продолжении или прекращении исследований.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать однородные образцы сухожилий для последующих молекулярных и биомеханических анализов, обеспечивая их готовность к исследованию.
- Практическая ценность: четко определенный протокол приготовления и инъекции PRP позволяет масштабировать скрининг соединений или биологических препаратов в моделях заживления сухожилий.
- Трансляционная ценность: методы гистологического окрашивания (например, трихром по Массону) и рабочие процессы экстракции РНК поддерживают разработку анализов, ориентированных на биомаркеры.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Анализ в конкретные временные точки (5, 15, 30 дней) отражает клиническую траекторию заживления, что позволяет оценить систему в контексте соответствующего заболевания.
- Операционная ценность: Биомеханическое тестирование с нормализацией по площади поперечного сечения обеспечивает стандартизированные показатели эффективности для доклинического этапа.
- Прогностическая ценность: Корреляция лечения PRP с повышенной прочностью на разрыв и увеличением количества фибриллярного коллагена способствует снижению механистических рисков перед проведением исследований для подачи заявки на IND.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез на ранних стадиях поиска, стандартизацию анализов при скрининге и подтверждение эффективности в трансляционных исследованиях.
- Биологические исследования: Способствует уточнению механизмов передачи сигналов и снижению биологических рисков за счет изоляции эффекта PRP на заживление сухожилия независимо от системных переменных.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированную подготовку заживающих тканей сухожилий для получения воспроизводимых биомеханических и молекулярных данных.
- Аналитика: Нормализация предела прочности при растяжении и количественное определение коллагена обеспечивают сравнительный анализ для ранжирования условий.
- Трансляционные исследования: Результаты гистологического и транскриптомного анализов согласуются с поиском биомаркеров и обеспечением преемственности на доклиническом этапе.
- Корпоративное повторное использование: Стандартизированная модель повреждения и рабочий процесс применения PRP могут быть адаптированы для различных заболеваний опорно-двигательного аппарата с целью повторного использования платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Механистическое снижение рисков применения PRP посредством количественной оценки прочности сухожилия и ремоделирования матрикса.
- Операционная ценность: Воспроизводимые методы хирургического вмешательства и инъекций обеспечивают согласованность результатов в разных центрах при проведении доклинических исследований.
- Стратегическая ценность: Оценка заживления на основе данных улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах программ по восстановлению сухожилий.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов на основе PRP с учетом рисков, исходя из функциональных результатов заживления.
Особенности реализации
- Для стабильного индуцирования повреждений требуется опыт проведения микрохирургических операций на грызунах и опыт работы с сухожилиями.
- Для приготовления PRP и биомеханической оценки необходим доступ к центрифуге, гематологическому анализатору и универсальной испытательной машине.
- Стандартизация активации PRP и объема инъекции для всех операторов имеет решающее значение для воспроизводимости результатов.
- Адаптация методики для других типов сухожилий или видов животных может потребовать пересмотра размера повреждения и дозировки PRP.
- Гистологические и молекулярные конечные точки требуют наличия инфраструктуры для обработки тканей (например, криохранилища, оборудования для экстракции RNA).
