Лабораторные методы, используемые для поддержания и дифференциации биотипов Vibrio cholerae Клинические и экологические изоляты

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы предоставить набор протоколов, которые просты в выполнении и могут помочь любому исследователю охарактеризовать данный клинический или экологический изолят холерного вибриона. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области бактериологии, такие как специфические генотипические и фенотипические характеристики любого изолята холерного вибриона, особенно те, которые имеют клиническое значение. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет любому исследователю использовать эту коллекцию анализов для надежной характеристики и различения клинических или экологических изолятов холерного вибриона.

В совокупности эти анализы обеспечивают систематический подход, который будет использоваться в качестве альтернативы или в дополнение к дорогостоящим трудоемким экспериментам и характеристике клинических изолятов холерного вибриона и изолятов окружающей среды. Хотя этот метод может дать представление о характеристике биотипов холерного вибриона, он также может быть применен для характеристики биохимических и метаболических возможностей других кишечных бактерий. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с управлением временем, поскольку время инкубации, необходимое для получения оптимальных результатов, различается в зависимости от биохимического анализа.

Визуальная демонстрация протоколов обнаружения пятен и колющих ран имеет решающее значение, поскольку брызги часто могут привести к перекрестному загрязнению, и требуется максимальное расстояние между культурами, чтобы предотвратить слияние между культурами. Начните протокол с гранулирования 1,8 мл жидкой культуры в течение двух минут путем центрифугирования при температуре не менее 8 600 xG в стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 900 мкл свежего бульона Лурия-Бертани или LB путем пипетирования.

Затем добавьте в культуру 900 мкл стерильного 60%-ного объемного глицерина и перемешайте методом вортексирования. Переложите смесь в стерильную криогенную пробирку объемом 2 мл и храните исходную культуру при температуре 80 градусов Цельсия. Чтобы использовать подвой, с помощью стерильной инокуляционной петли удалите небольшое количество замороженного подвойя и рассейте бактерии, чтобы получить отдельные колонии на пластинах из LB-агара.

Немедленно верните замороженный бульон до 80 градусов Цельсия после использования, чтобы предотвратить полное оттаивание культур. Инкубируйте пластины крышкой вниз в течение 12-16 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Получите заранее подготовленную тарелку.

Засейте 4 мл жидкого бульона LB в стерильную культуральную пробирку объемом 10 мл с одной колонией, прикоснувшись к поверхности одной колонии стерилизованной петлей и перенеся колонию в жидкий бульон. Затем инкубируйте культуру с аэрацией в шейкерном инкубаторе при 225 об/мин в течение 12-16 часов при 37 градусах Цельсия. Готовьте на ночь культуру в жидком отваре ЛБ.

На следующий день гранулируйте культуру и промойте клетки, повторно суспендируя клеточную гранулу в 1,8 мл 1x фосфатно-солевого буфера или PBS. Повторите процедуру стирки три раза. После третьей промывки проведите окончательную повторную суспендию в 1,8 мл 1x PBS.

Затем с помощью наконечника пипетки нанесите 1 мкл промытой культуры на соответствующую среду. Промойте ячейку гранулами, полученными из ночной культуры. Инокулируйте агаровые пластины для подвижности, вставив инокуляционный прокол в промытую жидкую культуру и вертикально вонзив в среду.

Убедитесь, что прививочный кол не согнулся во время прокалывания агара. Между каждой прививкой стерилизуйте проволочный кол с помощью горелки Бунзена. Инкубируйте пластины крышкой вверх в течение 14-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 14 часов внимательно следите за подвижностью пластин, чтобы не допустить разрастания культур. Ввести 4 мл бульона Метил-Ред Вогес-Проскауэр или MR-VP путем пипетирования 10 мкл предварительно приготовленной на ночь культуры в 4 мл бульона MR-VP в стерильной пробирке для культивирования и инкубировать с аэрацией в шейкер-инкубаторе при 225 об/мин в течение 12-16 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте 150 мкл 5% массы на объем альфа-нафтола и 50 мкл 40% массы на объем гидроксида калия к 1 мл аликвот МР-ВП на ночь в стерильных пробирках для культивирования соответственно.

Затем кратковременно закрутите трубки. Дайте пробиркам постоять при комнатной температуре до четырех часов, пока не проявится изменение цвета. Референсные штаммы биотипов и репрезентативные варианты El Tor были включены в генетический скрининг оснований ПЦР и фенотипические анализы для дифференциации биотипов клинических изолятов V.Cholerae и изолятов окружающей среды.

Классический O395 дикого типа продемонстрировал классические последовательности ctxB и tcpA. И наоборот, штаммы N16961 и C6706 дикого типа El Tor продемонстрировали последовательности El Tor ctxB и tcpA. MQ1795 и BAA-2163 содержат субъединицу классического биотипа ctxB, сравнимую с 0395.

Тем не менее, оба варианта Эль Тора содержали tcpA, указывающий на фон биотипа Эль Тора. При выращивании на пластинах агара LB с добавлением полимиксина B классический биотип дикого типа 0395 показал чувствительность к полимиксину B, в то время как штамм биотипа El Tor дикого типа показал устойчивость. Репрезентативные штаммы варианта Эль Тор продемонстрировали аналогичную устойчивость к антибиотику.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как различать биотипы холерного вибриона с помощью системы идентификации множественных анализов, описанной в этой рукописи. Не забывайте, что работа с патогенами BSL-2 может быть чрезвычайно опасной, и надлежащее обращение и утилизация всех материалов и отходов должны обеспечиваться в соответствии с институциональными, местными, государственными и федеральными правилами. В дополнение к протоколам, перечисленным в данной рукописи, дальнейшая характеристика изолятов холерного вибриона может быть достигнута путем изучения других фенотипических свойств, таких как образование биопленки и аутоагглютинация.