Комплексная система удаленно вызвать внутриклеточного сигнала по Upconversion наночастиц-опосредованной киназы Photoactivation

Цель этого эксперимента — продемонстрировать возможность фотоактивации фермента с помощью ближнего инфракрасного излучения. Кагед-протеинкиназа А иммобилизуется на этой поверхности наночастиц апконверсии, микроинъецируемых в клетки, и после облучения в ближнем инфракрасном диапазоне наблюдается индуцированный киназой ответ в живых клетках. Традиционная фотоактивация требует фототоксичного ультрафиолетового излучения и неизбежно вызовет нежелательную химическую реакцию и подобную реакцию, однако в наших дружественных вариантах, таких как ближний инфракрасный облучение, не может вызвать реакцию из-за своей низкой энергии.

Наночастицы с повышающей конверсией могут эффективно преобразовывать биологически чистые фотоны с низкой энергией ближнего инфракрасного диапазона в высокоэнергетические ультрафиолетовые фотоны, чтобы вызвать химическую реакцию вблизи поверхности частицы без прямого ультрафиолетового облучения. Киназа играет ключевую роль в онкогенезе, этот метод может помочь нам изучить больше информации о передаче сигнала с гораздо меньшим мешающим шумом от фототоксичности ультрафиолетового излучения и его побочных реакций. Как правило, люди, не знакомые с этой областью, сталкиваются с трудностями при модификации приборов и оптических настроек для применения с повышающим конверсией.

Для начала установите объектив с 4-кратным увеличением рядом с держателем кюветы флюорспектрометра, чтобы лазер можно было сфокусировать в середине кюветы. Поместите перестраиваемый лазерный диод 980 нанометров под углом 90 градусов к линзе объектива. Установите зеркало с полной отражательной способностью и пересечение светового пути линзы объектива и лазера.

Не забудьте разместить пластину из анодированного металла, чтобы перекрыть окно возбуждения спектрометра для защиты внутренних частей. Затем поместите в держатель кювету из покрытого диоксидом кремния раствора наночастиц апконверсии. При включении лазера можно визуализировать яркий луч повышающего конверсии.

Переключите спектроскопию в режим люминесценции с самым низким напряжением ФЭУ во время юстировки. Отрегулируйте зеркальные и лазерные столики таким образом, чтобы луч проходил через середину кюветы, чтобы ФЭУ улавливал самый сильный сигнал. После установки дихроичного зеркала и фильтра возбуждения установите лазерный диод 980 нанометров в нижнем ярусе светового тракта.

Добавьте коллиматор между лазером и зеркалом, чтобы помочь диффундировать и увеличить область облучения в ближнем ИК-диапазоне в фокальной плоскости. Затем используйте раствор наночастиц с повышающей конверсией для визуализации ближнего инфракрасного луча. Отрегулируйте положение лазерного столика, чтобы центрировать луч ближнего инфракрасного света, чтобы завершить юстировку.

Выполните синтез caged-PKA и демобилизуйте caged-PKA/UCNP для генерации caged-PKA/UCNP, как описано в текстовом протоколе. Чтобы измерить активность обеих конструкций перед УФ-фотолизом, измерьте снижение абсорбентов NADH в смеси для анализа с течением времени после добавления двух микролитров раствора ПКА в смесь для анализа. Повторите измерение для PKA/UCNP.

Затем проведите УФ-фотолиз с концентрацией 200 милливатт на квадратный сантиметр ПКА и ПКА/УКНП в ледяной водяной бане, чтобы убедиться в возможности активации ПКА. Активность ПКА определяют с помощью фермента, сопряженного с пируваткиназой лактатдегидрогеназой. При снижении поглотителей НАДН, измеряется со временем после добавления раствора ПКА.

Инкубируйте клетки в 10%-ной фетальной бычьей сыворотке, содержащей среду L15, в период микроинъекции для стабильного контроля pH вне инкубатора. Сконфигурируйте съемник игл для конусообразного наконечника диаметром около 1,5 микрон для последующего раскрытия кончика. Чтобы открыть наконечник, установите иглу на микроинъектор, переместите кончик иглы в соприкосновение с краем предметного стекла и проведите мягкой ручкой по предметному столику микроскопа.

Этой силы вибрации достаточно, чтобы немного сломать наконечник и увеличить отверстие. Осмотрите отверстие иглы, чтобы убедиться, что оно имеет внешний диаметр от 1,3 до 1,5 микрон, что можно подтвердить с помощью изображений микроскопа с объективом 40x. Затем установите давление впрыска от 50 до 75 гектопаскалей с интервалом под давлением от 200 до 300 миллисекунд и установите постоянное компенсационное давление на уровне от 15 до 30 гектопаскалей для предотвращения обратного тока среды в иглу.

Загрузите комплекс Caged-PKA/UCNP с красителем TAMRA в обратном положении иглы. Затем загруженная игла устанавливается на одну ось гидравлического микроманипулятора, с углом от 30 градусов до 45 градусов. Проверьте иглу с помощью микроскопа, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков, образующихся после загрузки образца.

После погружения иглы в среду переключитесь в режим флуоресценции, чтобы подтвердить взрывное высвобождение красителя при приложении давления впрыска и медленное высвобождение красителя при постоянном приложении компенсационного давления. Затем переключитесь в фазово-контрастный режим яркого поля, чтобы начать микроинжекцию клетки. Мембранная ударная волна может наблюдаться при успешных инъекциях.

Дважды промойте клетки и проверьте введенные клетки на наличие совместной флуоресценции TAMRA, чтобы обнаружить успешно введенные микроинъекции. Клетки с введением UCNP, но без совместного ввода сигнала красителя, указывают на то, что клеточная мембрана была разорвана во время инъекции и должны быть исключены из дальнейших экспериментов. Облучайте ячейки лазерным диодом с яркостью 980 нанометров в нижнем ярусе света, сфокусированном объективом с 10-кратным увеличением, в течение 15 минут.

Оставьте пятиминутный темный интервал после каждых пяти минут облучения, чтобы избежать нагрева. Если требуется более короткое время активации, например секунды или даже доли секунды, просто переключитесь на объектив с 40-кратным увеличением для более высокой плотности фокусных фотонов. После фотолиза и восстановления клеток зафиксировать клетки в одном миллилитре или 4% параформальдегиде в PBS в течение 20 минут, после чего следует дальнейшее окрашивание Alexa 594.

Наконец, визуализируйте индуцированный NIR распад волокон напряжения. После NIR-облучения клетки, микроинъецированные CAGED-PKA/UCCNP, как показано белыми стрелками, демонстрируют эмиссию апконверсии. Стрессовый распад волокон, вызванный успешной фотоактивацией PKA NIR, обнажает больше f-актина и, следовательно, приводит к сильному зеленому окрашиванию вблизи UCNP.

Отрицательный контроль, при котором клетки подвергаются микроинъекциям, но остаются в темноте, не показывают распада стрессовых волокон. Уровень воздействия f-актина после фотоактивации NIR может быть окрашен с помощью alexa 594 с последующим последующим и количественно оцененным изображением J. Были построены кривые интенсивности окрашивания f-актина вдоль красной стрелки, что дает количественную информацию о распаде стрессовых волокон, которая может быть коррелирована с активностью, вызванной NIR-индуцированной. После знакомства с микроинъекцией этот метод может быть выполнен в течение одного дня, включая подготовку и контроль качества Caged-PKA/UCNP.

С помощью наших инструкций по модификации приборов и экспериментам желаемая реакция может быть вызвана ближним инфракрасным излучением с высоким пространственным временным разрешением, как традиционный ультрафиолетовый свет для методов титрования, но без фототоксичности он не заразен. После просмотра этого видео вы можете надеяться, что у вас сложилось хорошее понимание того, как доставить комплекс наночастиц фермента в клетку с помощью микроинъекции и фотоактивировать фермент с помощью совместимого с колоколом ближнего инфракрасного света. Этот метод проложил путь для исследователей в области химической биологии, которым необходимо использовать свет для запуска желаемой ферментативной реакции в живых клетках для пространственного временного разрешения, когда клетка не может переносить ультрафиолетовую фототоксичность.

После этой процедуры другие биоаффекторы могут быть связаны с наночастицами с апконверсионной версией, чтобы ответить на дополнительные вопросы, требующие пространственно-временной фотоактивации. Если биоаффектор работает внеклеточно, микроинъекция даже не нужна. Платформа фотоактивации в ближнем инфракрасном диапазоне также может обеспечить большую глубину проникновения в ткани и, следовательно, может применяться у мелких животных для запуска желаемых реакций в заданное время и в заданном месте.