Комплексная система удаленно вызвать внутриклеточного сигнала по Upconversion наночастиц-опосредованной киназы Photoactivation

Цель данного эксперимента — продемонстрировать возможность фотоактивации фермента с помощью облучения в ближнем инфракрасном диапазоне. «Заблокированная» протеинкиназа А иммобилизована на поверхности наночастиц с преобразованием частоты, которые вводятся в клетки методом микроинъекций; после облучения в ближнем инфракрасном диапазоне наблюдается вызванный киназой ответ в живых клетках. Традиционная фотоактивация требует использования фототоксичного УФ-излучения, что неизбежно приводит к сопутствующим нежелательным химическим реакциям и аналогичным ответам, в то время как предлагаемый нами щадящий вариант, такой как облучение в ближнем инфракрасном диапазоне, не может спровоцировать такие реакции из-за своей низкой энергии.

Наночастицы с апконверсионными свойствами способны эффективно преобразовывать биосовместимые низкоэнергетические фотоны ближнего ИК-диапазона в высокоэнергетические УФ-фотоны для запуска химической реакции у поверхности частицы без прямого УФ-облучения. Поскольку киназы играют ключевую роль в онкогенезе, данный метод позволяет получить больше данных о передаче сигналов при значительном снижении уровня помех, вызванных УФ-фототоксичностью и побочными реакциями. Как правило, специалисты, только начинающие работать в этой области, сталкиваются с трудностями при модификации приборов и настройке оптической схемы для применения апконверсии.

Для начала установите объектив с увеличением 4x рядом с кюветным отделением флуороспектрометра так, чтобы лазер мог быть сфокусирован в центре кюветы. Расположите перестраиваемый лазерный диод с длиной волны 980 nanometer под углом 90 градусов к объективу. Установите зеркало полного отражения в точку пересечения путей света от объектива и лазера.

Не забудьте установить анодированную металлическую пластину, чтобы закрыть окно возбуждения спектрометра для защиты внутренних компонентов. Затем поместите в держатель кювету с раствором наночастиц с апконверсией, покрытых диоксидом кремния. При включении лазера будет виден яркий луч апконверсии.

Переключите спектроскоп в режим люминесценции, установив минимальное напряжение ФЭУ на время юстировки. Отрегулируйте положение зеркала и лазерных кареток так, чтобы луч проходил через центр кюветы, обеспечивая максимальный сигнал на ФЭУ. После установки дихроичного зеркала и возбуждающего фильтра установите лазерный диод с длиной волны 980 nanometer в нижний тракт освещения.

Установите коллиматор между лазером и зеркалом, чтобы рассеять и увеличить область облучения в ближнем ИК-диапазоне в фокальной плоскости. Затем используйте раствор наночастиц с апконверсионной люминесценцией для визуализации луча ближнего ИК-диапазона. Отрегулируйте положение предметного столика лазера, чтобы центрировать луч ближнего ИК-излучения и завершить юстировку.

Проведите синтез caged-PKA и иммобилизуйте caged-PKA/UCNP для получения caged-PKA/UCNP, как описано в текстовом протоколе. Чтобы измерить активность обеих конструкций перед УФ-фотолизом, измерьте снижение поглощения NADH в смеси для анализа с течением времени после добавления 2 µL раствора PKA в смесь для анализа. Повторите измерение для PKA/UCNP.

Затем проведите УФ-фотолиз caged-PKA и caged-PKA/UCNP при мощности 200 milliwatts per square centimeter в ледяной водяной бане, чтобы убедиться в возможности активации PKA. Активность PKA определяют с помощью сопряженного ферментативного анализа с использованием пируваткиназы и лактатдегидрогеназы. Снижение поглощения NADH измеряют в динамике после добавления раствора PKA.

Инкубируйте клетки в 10% фетальной бычьей сыворотке с использованием среды L15 в течение периода микроинъекций для стабильного контроля pH вне инкубатора. Настройте вытяжной прибор для создания конусообразного кончика иглы с диаметром около 1,5 мкм для последующего раскрытия кончика. Чтобы раскрыть кончик, установите иглу в микроинъектор, приведите кончик иглы в контакт с краем предметного стекла и осторожно переместите его с помощью винта перемещения предметного столика микроскопа.

Этой силы вибрации достаточно, чтобы слегка сколоть кончик и расширить отверстие. Осмотрите отверстие иглы, чтобы убедиться, что его внешний диаметр составляет от 1,3 до 1,5 микрон, что можно подтвердить с помощью изображений под микроскопом с использованием объектива 40x. Затем установите давление инъекции в диапазоне от 50 до 75 гектопаскалей с интервалом подачи от 200 до 300 миллисекунд и установите постоянное компенсирующее давление от 15 до 30 гектопаскалей, чтобы предотвратить обратный ток среды в иглу.

Загрузите комплекс caged-PKA/UCNP с красителем TAMRA в заднюю часть иглы. Затем установите загруженную иглу на одноосевой гидравлический микроманипулятор под углом от 30 до 45 градусов. Проверьте иглу под микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха после загрузки образца.

После погружения иглы в среду переключитесь в режим флуоресценции, чтобы подтвердить резкий выброс красителя при подаче давления впрыска и медленное высвобождение красителя при постоянном поддерживающем давлении. Затем переключитесь в режим фазово-контрастной светлой области, чтобы начать микроинъекцию в клетки. При успешных инъекциях можно наблюдать ударную волну мембраны.

Промойте клетки дважды и проверьте введенные клетки на наличие ко-инъекционной флуоресценции TAMRA, чтобы определить успешно микроинъектированные клетки. Клетки, в которые были введены UCNP, но в которых отсутствует сигнал ко-инъекционного красителя, указывают на разрыв клеточной мембраны во время инъекции; такие клетки следует исключить из дальнейших экспериментов. Облучайте клетки лазерным диодом с длиной волны 980 nanometer в нижнем ярусе светового пути, сфокусированным с помощью объектива 10x, в течение 15 minutes.

Чтобы избежать перегрева, после каждых пяти минут облучения делайте пятиминутный перерыв в темноте. Если требуется более короткое время активации (секунды или даже доли секунды), просто переключитесь на объектив 40x для достижения более высокой плотности потока фотонов в фокусе. После фотолиза и восстановления клеток зафиксируйте их в 1 мл 4% параформальдегида в PBS в течение 20 минут, после чего проведите окрашивание с использованием Alexa 594.

Наконец, визуализируйте дезинтеграцию стресс-фибрилл, индуцированную NIR-излучением. После NIR-облучения клетки, в которые были микроинъецированы caged-PKA/UCNP (отмечены белыми стрелками), демонстрируют апконверсионную эмиссию. Дезинтеграция стресс-фибрилл, вызванная успешной NIR-фотоактивацией PKA, высвобождает больше f-актина и, следовательно, приводит к интенсивному зеленому окрашиванию вблизи UCNP.

Отрицательный контроль, при котором клетки подвергались микроинъекции, но оставались в темноте, не показал деградации стресс-фибрилл. Степень экспозиции f-актина после БИК-фотоактивации может быть определена с помощью окрашивания Alexa 594 с последующим количественным анализом в ImageJ. Были построены кривые интенсивности окрашивания f-актина вдоль красной стрелки, что позволило получить количественные данные о деградации стресс-фибрилл, которые можно сопоставить с БИК-индуцированной активностью PKA. После освоения метода микроинъекций данная процедура может быть выполнена за один день, включая подготовку и контроль качества caged-PKA/UCNP.

С помощью наших инструкций по модификации приборов и проведению экспериментов можно инициировать желаемую реакцию с помощью ближнего ИК-излучения с таким же высоким пространственно-временным разрешением, как при использовании традиционного УФ-излучения в методах титрования, но без фототоксичности, так как этот метод не является повреждающим. Мы надеемся, что после просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как с помощью микроинъекций доставить комплекс фермента и наночастиц в клетку и фотоактивировать фермент, используя совместимый с биологическими объектами свет ближнего ИК-диапазона. Данный метод открывает новые возможности для исследователей в области химической биологии, которым необходимо использовать свет для запуска определенной ферментативной реакции в живых клетках с высоким пространственно-временным разрешением в случаях, когда клетки не переносят фототоксичности УФ-излучения.

После выполнения данной процедуры к наночастицам с апконверсией можно присоединить другие биоактивные агенты для решения дополнительных задач, требующих пространственно-временной фотоактивации. Если биоактивный агент действует внеклеточно, микроинъекции не требуются. Платформа для фотоактивации в ближнем ИК-диапазоне также обеспечивает большую глубину проникновения в ткани, поэтому её можно применять на мелких животных для запуска необходимых реакций в заданное время и в определенном месте.