Анализ белково-белковых взаимодействий и ко-локализация между компонентами разрывов, затянутых и адгезивных соединений в молочных железах мышей

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы определить, колокализуются ли два или более белков межклеточного соединения в клетках, и дополнительно оценить их физическое взаимодействие посредством ко-иммунопреципитации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии молочной железы, включая роль соединений в нормальном развитии и таких заболеваниях, как рак молочной железы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может предоставить значительную информацию о белок-белковом взаимодействии in vivo при относительно низких затратах.

Чтобы выполнить ко-иммунофлуоресцентное окрашивание, достаньте соответствующие микроскопические стекла из морозильной камеры. Немедленно зафиксируйте срезы, погрузив их в четырехпроцентный формальдегид на 15 минут при комнатной температуре. Затем погрузите предметные стекла в фосфатно-солевой буфер комнатной температуры.

Оставьте слайды там до перехода к следующему шагу. Обведите каждую секцию предметного стекла с помощью имеющегося в продаже гидрофобного барьера или водоотталкивающей лабораторной ручки. Немедленно добавьте капли PBS в ткань и поместите предметное стекло в гистологическую камеру человека на оставшуюся часть процедуры.

Заблокируйте каждый участок ткани 100-200 микролитрами трехпроцентного буферного раствора альбумин-трис-соли бычьей сыворотки, 0,1% полисорбата-20, в течение 30 минут при комнатной температуре. Пока образцы блокируются, готовят первичный и вторичный растворы антител, разводя антитела в TBS 0,1% полисорбата-20. После удаления блокирующего раствора методом аспирации инкубируйте срезы в 100-200 микролитрах разведенного первичного антитела в течение 60 минут при комнатной температуре.

Затем удалить первичный раствор антитела методом аспирации и промыть срезы от 250 до 500 микролитров TBS 0,1%полисорбата-20 в течение пяти минут. Удалите раствор для стирки с помощью аспирации, прежде чем повторить стирку дважды. Отсадите промывочный раствор и инкубируйте срезы со 100-200 микролитрами соответствующего конъюгированного вторичного антитела Fluoro-4 в течение 60 минут при комнатной температуре.

После удаления вторичного раствора антитела методом аспирации срезы промывают от 250 до 500 микролитров TBS 0,1%полисорбата-20 в течение пяти минут. Удалите раствор для стирки и повторите дважды. Повторите эти шаги, используя соответствующую комбинацию первичных и вторичных тел для любых последующих белков, представляющих интерес.

После удаления окончательной промывки выполните окрашивание ядер путем инкубации среза со 100 до 200 микролитрами одного миллиграмма на миллилитр DAPI и TBS 0,1% полисорбата-20 в течение пяти минут при комнатной температуре. Отсадите раствор DAPI и установите слайды с помощью водорастворимой, нефлуоресцентной монтажной среды и защитных стекол. Поместите предметные стекла в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия не менее чем на восемь часов.

Приступайте к флуоресцентной микроскопической визуализации, как описано в текстовом протоколе. Соберите от 500 до 1000 микрограммов лизата и разведите его в PBS до конечного объема 200 микролитров в каждой 1,5-миллилитровой пробирке. Добавьте антитело против интересующего антигена в первую пробирку с лизатом и держите его на льду.

Инкубируйте пробирки в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на трубочно-роликовом миксере на низкой скорости. На следующий день добавьте 50 микролитров магнитных шариков в новые 1,5-миллилитровые тюбики для предварительной промывки. Поместите трубки с бусинами на магнитную подставку и позвольте бусинам мигрировать к магниту.

Извлеките буфер для хранения из шариков с помощью пипетки объемом 200 микролитров. Промойте бусины, добавив 500 микролитров PBS 0,1% полисорбата-20, и энергично перебейте трубки в течение 10 секунд. Затем поместите трубки обратно на магнитную подставку и позвольте бусинам мигрировать к магниту.

Удалите излишки буфера для промывки с помощью пипетки с помощью пипетки объемом 200 микролитров. Добавьте в гранулы реакционный комплекс антител к лизату и инкубируйте в течение 90 минут при комнатной температуре на роликовом миксере. После инкубации поместите трубки на магнитную подставку и дайте бусинам мигрировать к магниту.

С помощью пипетки объемом 200 микролитров отсадите и выбросьте лизат и поместите пробирки на лед. Дважды промойте бусины, добавив 500 микролитров PBS, поместив трубки на магнитную подставку и удалив жидкость, как и раньше. Во время этапов промывки избегайте завихрения и держите образцы на льду.

Один раз промойте шарики PBS 0,1%полисорбатом-20 без завихрения и выбросьте последний буфер для промывки с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров. Чтобы вымыть, добавьте в трубочки 20 микролитров 0,2 молярного кислого глицина и встряхивайте их в течение семи минут на роликовом миксере. После центрифугирования на высокой скорости в течение нескольких секунд соберите надосадочную жидкость в свежую, ледяную пробирку.

Повторите шаги промывки и элюирования для каждой тюбика. Затем добавьте 10 микролитров 4x буфера к 40-микролитровому элюированному образцу. Сразу же добавьте по одному моляру Триса к элюированным образцам, по одной капле за раз, пока его цвет не станет синим, а затем приступайте к следующим пробиркам.

Кипятите элюированные образцы при температуре от 70 до 90 градусов Цельсия в течение 10 минут. Загрузите подготовленные лизаты и осажденные образцы бок о бок в акриламидный гель SDS-PAGE. Запустите гель в рабочем буфере при напряжении 100 вольт в течение примерно 95 минут или до тех пор, пока край мигрирующих белков не достигнет дна геля.

Затем перенесите гели на мембрану из нитроцеллюлозы или ПВДФ по стандартному протоколу. Затем заблокируйте мембрану на один час на коромысле на малых оборотах в пятипроцентном сухом молоке TTBS. Чтобы определить, было ли осаждение успешным, прозондируйте мембрану с помощью первого антитела против осажденного белка.

Разведите его в пятипроцентном сухом молоке TTBS в концентрации, рекомендованной производителем. Инкубируйте мембрану в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на качающейся платформе с медленным перемешиванием. На следующий день промойте мембрану три раза по пять минут каждый с ТТБС на качающейся платформе с высоким перемешиванием.

Затем инкубируют мембрану в соответствующем вторичном антителе, конъюгированном с пероксидазой хрена, разведенной в TTBS, в течение одного часа при комнатной температуре на качающейся платформе с медленным перемешиванием. Выполните от трех до шести стирок, каждое в течение пяти минут, с TTBS на качающейся платформе с сильным перемешиванием. Проанализируйте сигнал вторичного антитела путем инкубации мембраны с коммерчески доступным раствором люминола и следуйте инструкциям производителя.

Обнаружение сигнала с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Чтобы идентифицировать взаимодействующие белки, повторите эти шаги с использованием соответствующих антител на том же блоте. Чтобы определить, могут ли компоненты щелевого соединения, адгезионного соединения и плотного соединения взаимодействовать друг с другом в молочной железе, были проведены коиммунофлуоресцентные анализы.

Коиммунофлюоресцентный анализ показывает, что бета-катенин, интегральный белок адгезивного соединения, и коннексин 26, белок щелевого соединения, совместно локализуются на клеточной мембране в молочных железах мышей на седьмой день лактации, что отражено в желтом цвете. Ядра клеток визуализируются с помощью окрашивания синим DAPI. Криосрезы молочных желез на 18-й день беременности были разрезаны и иммунофлуоресцентно окрашены на Claudin 7, белок плотного соединения, показанный зеленым цветом, E-Cadherin, белок адгезивного соединения, показанный красным, и Connexin 26, белок щелевого соединения, показанный коралловым синим.

Ядра были окрашены в синий цвет DAPI. Колокализация E-Cadherin и Claudin 7 отображается в виде желтого или светло-оранжевого цвета, в то время как колокализация Connexin 26 с E-Cadherin и Claudin 7 привела к окрашиванию белыми точками. Чтобы выяснить, какие соединительные белки смешиваются и физически связываются друг с другом на клеточной мембране, была проведена ко-иммунопреципитация с использованием тканей молочной железы кормящих мышей.

Результаты показали, что Connexin 43, компонент щелевого перехода, взаимодействует с E-кадгерином и Claudin 7, но не с Claudin 3. Эти результаты были подтверждены реципрокной иммунопреципитацией. Когда E-кадгерин подвергался иммунопреципитации, он взаимодействовал с Connexin 43 и Claudin 7.

После освоения эта техника может быть выполнена за два дня для коиммунофлюоресценции для четырех-восьми слайдов, а слайды могут быть визуализированы на следующий день, если она выполнена правильно. При проведении процедуры коиммунофлюоресценции важно помнить о выборе различных конъюгированных антител Fluoro 4, выращенных в разных пространствах с неперекрывающимися длинами волн, и выбрать подходящие магнитные гранулы белка A или G, совместимые с антителами, используемыми для ко-иммунопреципитации. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению взаимодействия межклеточных соединений в мышиных молочных железах.

Не забывайте, что работа чрезвычайно опасна и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.