Протоколы для сборки ДНК ДНК C-Brick с использованием Cpf1

В следующих видеороликах подробно описана процедура использования стандарта C-Brick для сборки частей ДНК с использованием CRISPR-ассоциированного белка Cpf1. Этот метод может способствовать дальнейшему развитию сборки ДНК в области синтетической биологии. Например, путем облегчения построения сложных генетических цепей.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он не зависит от последовательности и позволяет проводить итерационную сборку конструкций ДНК. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы заметили, что Cpf1 управляется одной миРНК и каталитической ДНК. Следовательно, генерация DKN.

Демонстрировать процедуру будет Ши-Юань Ли, аспирант моей лаборатории. Чтобы восстановить матрицы crRNA, повторно суспендируйте отдельные олигонуклеотиды в свободной от РНКазы воде до концентрации 10 микромоляров. В пробирку для ПЦР объемом 0,2 миллилитра добавьте олигонуклеотид верхней цепи, олигонуклеотид нижней цепи и 10-кратный буфер для отжига, как описано в сопроводительном документе.

Следите за тем, чтобы общий объем составлял 50 микролитров. В этой таблице показаны шесть различных олигонуклеотидов нижней цепи, каждый из которых должен быть индивидуально спарен с верхней цепью, T7-F. Строчными буквами обозначена последовательность, которая должна быть транскрибирована в направляющую последовательность crRNA.

Поместите пробирку для ПЦР в термоамплификатор. Запустите программу отжига с начальной денитрацией при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем охлаждением с 95 до 20 градусов Цельсия с уменьшением на один градус Цельсия в минуту. После отжига немедленно выполните транскрипцию, соединив отожженный продукт со свободной водой РНКазы, транскрипционным буфером Т-7, смесью NTP, ингибитором рекомбинантной РНКазы и полимеразой Т-7 РНКазы в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров

Инкубируйте реакцию на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день используйте набор для очистки и концентрации РНК для очистки транскрибируемой РНК. Используйте УФ-ВИД спектрофотометр для количественного определения РНК.

Затем разбавьте РНК до концентрации 10 микромоляров. Если образцы не используются сразу, храните их при температуре 80 градусов Цельсия. Строительство деталей из C-Brick может быть выполнено несколькими методами.

В этом разделе видео три хромопротеиновые кассеты, cjBlue, eforRed и amilGFP, будут собраны методом бесшовной сборки. Начните с проектирования и заказа олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации хромопротеиновых кассет. Когда олигонуклеотиды появятся, повторно суспендируйте их в ультрачистой воде до концентрации 10 микромоляров.

Далее, чтобы настроить реакции ПЦР, поместите на лед 0,2 миллилитровые ПЦР-пробирки. Добавьте сверхчистую воду, два буфера XPCR, DNTP, прямые и обратные праймеры, хромопротеиновую матрицу и высокоточную ДНК-полимеразу. Поместите трубки непосредственно в амплификатор и запустите программу.

Используйте образцы сразу или заморозьте и храните при температуре 20 градусов Цельсия. После амплификации очистите продукты ПЦР с помощью набора. Далее, чтобы переварить стандартный вектор C-Brick с BamH1, добавьте в пробирку сверхчистую воду, плазмиду, 10-кратный буфер и BamH1.

Выдерживать до двух часов при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане. Очистите линеаризованный вектор с помощью набора для очистки гелем. После очистки объедините линеаризованный вектор, продукт ПЦР, 5-кратный бесшовный буфер для сборки и бесшовный сборочный фермент из бесшовного сборочного комплекта в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров.

Следите за тем, чтобы общий объем составлял 10 микролитров. Поместите его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут. После инкубации используйте образцы сразу или заморозьте их на льду и храните при температуре 20 градусов Цельсия.

К 90 микролитрам кишечной палочки DH10B добавьте 10 микролитров конструкта. Проведите химическое превращение. Затем распределите трансформированные клетки на LB-планшете и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день выберите несколько клонов для культивирования в пятимиллилитровых жидких пробирках LB и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в шейкере при 220 оборотах в минуту на ночь. Извлеките плазмиду с помощью набора для подготовки плазмид. Затем определите правильные клоны с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Знайте, что построение путей C-Brick также может быть достигнуто с помощью реактивного применения PCI или путем ограничения немедленного расщепления среды Т4-ДНК-лигазы до лигирования. Затем, чтобы расщепить вектор C-Brick с Cpf1, смешайте свободную РНКазу воду, 10x буфер Cpf1, плазмиду, ингибитор рекомбинантной РНКазы и Cpf1 в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров. Чтобы вставить чужеродный фрагмент ДНК в сайты Т1 и Т2, добавьте один микролитр crRNA T2 и инкубируйте пробирку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем, держа трубку на водяной бане, добавьте один микролитр crRNA T1, один микролитр Cpf1 и выдерживайте еще 30 минут. Сначала добавляется crRNA T2, потому что два сайта узнавания находятся ближе на векторной ДНК. Связывание Cpf1 с сайтом Т1 может влиять на залегание сайта Т2.

Кроме того, если бы сайт T2 заменял сайт T2, сайт T2 был бы нарушен, если бы сначала была добавлена crRNA T1. Добавьте один микролитр термочувствительной щелочной фосфатазы и выдержите пробирку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия еще час. Проведите электрофорез в агарозном геле и очистите вектор с помощью набора для очистки гелем.

Используйте образцы сразу или заморозьте и храните при температуре 20 градусов Цельсия. Чтобы расщепить интересующий фрагмент ДНК с помощью Cpf1, смешайте свободную от РНКазы воду, 10x буфер Cpf1, плазмиду, ингибитор рекомбинантной РНКазы и Cpf1 в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров. Чтобы вставить чужеродный фрагмент ДНК в сайты Т1 и Т2, добавьте в пробирку один микролитр crRNA T1 и один микролитр crRNA T3 и инкубируйте его на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.

После инкубации проведите электрофорез в агарозном геле и очистите фрагмент с помощью набора для очистки гелем. Используйте образцы сразу или заморозьте и храните при температуре 20 градусов Цельсия. Затем, чтобы лигировать чужеродный фрагмент ДНК в векторе C-Brick, объедините линеаризованный вектор и фрагмент ДНК в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров

Добавьте 10x буфер T4 DNA Ligase и T4 DNA Ligase. Затем инкубируйте в течение двух часов при температуре 22 градуса Цельсия. Используйте образцы сразу или заморозьте и храните при температуре 20 градусов Цельсия.

Добавьте 10 микролитров продуктов лигирования к компетентным клеткам кишечной палочки DH10B и проведите химическую трансформацию. Затем распределите трансформированную кишечную палочку на планшеты LB и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день добавьте несколько клонов в 5-миллилитровые жидкие пробирки LB и инкубируйте их на ночь в шейкере при 220 об/мин и 37 градусах Цельсия.

Извлеките плазмиду с помощью набора для подготовки плазмид. Затем определите правильные клоны с помощью секвенирования по Сэнгеру. Выполните новый раунд сборки C-Brick.

Используя образец, так называемые клоны крэка могут быть использованы в качестве нового вектора C-Brick или фрагмента ДНК для дальнейшей итерационной сборки C-Brick. Три хромопротеиновые кассеты, cjBlue, eforRed и amilGFP, были собраны, как описано в этом видео. Три хромопротеина экспрессировались в кишечной палочке, выращенной на тарелке.

Бактерии отрицательного контроля, не имеющие хромопротеинов, показаны на четвертой пластине. Впоследствии две кассеты с цветовой выразительностью были дополнительно собраны по стандарту C-Brick для создания большего количества цветов. Три хромопротеида и три собранных двойных хромопротеина экспрессировались в кишечной палочке, выращенной в жидкой среде LB.

От одного до шести выражаются следующие конструкции: eforRed, один, amilGFP, два, cjBlue, три, amilGFP плюс eforRed, четыре, eforRed плюс cjBlue, пять, и amilGFP плюс cjBlue, шесть. Красочные бактерии на одном планшете или в одной микроцентрифужной пробирке культивировались из одного проверенного клона. После освоения этой техники ее можно сделать за одну неделю, если она выполнена правильно.

При проведении этой процедуры важно помнить, что все материалы должны быть свободны от РНКазы для получения миРНК и клиренса Cpf1. Я по-прежнему рекомендую, эта тактика помогла исследователям в области синтетической биологии построить генетическую витрину метаболических путей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как собрать путь ДНК с помощью стандарта C-Brick.