Анализ макрофагов Microglia и Monocyte из центральной нервной системы методом проточной цитометрии

Общая цель этого эксперимента — оценить различные маркеры, экспрессируемые субпопуляциями макрофагов в центральной нервной системе или ЦНС. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроиммунологии, такие как макрофаги, когда мы пытаемся вызвать головокружение у ЦНС, и каковы фенотипы ЦНС в макрофагах. Основными преимуществами данной методики являются выделение большого количества высокоочищенных макрофагальных субпопуляций, а также контификация маркера макрофагальных субпопуляционных клеток.

Начните с использования тонких ножниц, чтобы разрезать вентральную кожу чуть ниже мечевидного отростка, чтобы обнажить грудную полость. Сделайте надрез в диафрагме и разрежьте боковые стороны грудной клетки в каудальном и ростральном направлении, чтобы обнажить сердце. После определения левого желудочка и правого предсердия введите катетер-бабочку с иглой 25 Гааж в левый желудочек.

Сделайте надрез на правом предсердии и начните прокачивать 20 миллилитров PBS через катетер со скоростью десять миллилитров в минуту, как только кровь начнет течь. На успешное изобилие будет свидетельствовать побледнение легких и печени по мере вытеснения крови. Затем с помощью тонких ножниц рассеките позвоночный столб.

Иссечение мускулатуры брюшной стенки на вентральной стороне позвоночного столба и разрезание позвоночного столба у основания хвоста для удаления позвоночника по мере его забора. Введите десятимиллилитровый шприц PBS, оснащенный модифицированным наконечником пипетки на 200 микролитров, в поясничную сторону позвоночного столба. Затем промойте спинной мозг с шейной стороны.

Снимите кожу над черепом и вставьте один кончик ножниц у основания черепа. Разрежьте черепную коробку по сагиттальному шву. Затем вставьте в разрез небольшие щипцы и аккуратно удалите верхнюю часть черепа.

Препарируйте мозг с головы мыши и удалите обонятельную луковицу и мозжечок. Затем поместите головной и спинной мозг в одну целую пятимиллилитровую трубку, содержащую одну целую две восемь миллилитров пищеваренного коктейля. Чтобы диссоциировать клетки, с помощью небольших ножниц тонко разрежьте головной и спинной мозг на один-два кубических миллиметра и поместите их при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа на 30 минут.

В конце инкубации остановите переваривание с помощью 20 микролитров нулевой пятерки молярной ЭДТА, после чего следует легкая растирание пятимиллилитровой пипеткой. Отфильтруйте полученную клеточную суспензию через сетчатое фильтр 70 микрон в коническую трубку объемом 50 миллилитров с помощью поршня десятимиллилитрового шприца, чтобы аккуратно мацерировать любую оставшуюся ткань головного или спинного мозга. Промойте ситечко 20 миллилитрами пятипроцентного FBS и PBS.

И собрать отфильтрованные ячейки методом центрифугирования. Затем осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Для разделения ячеек по градиенту плотности мы суспензируем гранулу четырьмя миллилитрами среды с 30-процентным градиентом плотности и переносим клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Аккуратно нанесите четыре миллилитра среды с градиентом плотности 37 процентов, а затем четыре миллилитра среды с градиентом плотности 70 процентов под среду с градиентом плотности 37 процентов. Перенесите пробирку в настольную центрифугу, чтобы разделить ячейки. Клетки микроглии и макрофагов будут находиться на границе слоев с 70 и 37 процентами градиента плотности.

Трубка будет казаться расслоенной. Осторожно удалив верхний слой миелина, перенесите три-четыре миллилитра межфазного слоя макрофагов микроглии в новую 15-миллилитровую пробирку. Затем промойте иммунные клетки тремя центрифугами в 15 миллилитрах PBS, повторно взвесив гранулу в одном миллилитре PBS после окончательной промывки.

Чтобы оценить экспрессию маркеров субпопуляции макрофагов, перенесите клетки в проточную пробирку для анализа проточной цитометрии объемом пять миллилитров с последующим добавлением одного микролитра фиксируемого реагента для окрашивания мертвых клеток. После 30 минут на льду, защищенном от света, промойте образцы в двух миллилитрах PBS и повторно суспендируйте гранулу в 400 микролитрах факс-буфера на экспериментальную пробирку для анализа. Разделите клетки на соответствующее количество пятимиллилитровых пробирок проточного цитометрического анализа.

Затем блокируйте связывание неспецифических рецепторов FC с помощью одного микрограмма коктейля антител CD 16 CD 32 на 100 микролитров клеток в течение 10-15 минут инкубации на льду, защищенном от света. Далее пометьте клетки 100 микролитрами соответствующих первичных антител, для 30-минутной инкубации на льду, защищенном от света. По окончании инкубации промойте клетки в двух миллилитрах PBS четыре раза.

Затем добавьте 100 микролитров соответствующих вторичных антител в течение 30 минут на лед, защищенный от света, после чего последует четыре полоскания в PBS, как только что продемонстрировано. После последней стирки аккуратно повторно суспензируйте гранулы в 100 микролитрах однопроцентного параформальдегида на 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Затем четыре раза промыть клетки в PBS.

Повторно суспендируйте готовые гранулы в 200 микролитрах свежего PBS и проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии. Микроглия головного и спинного мозга и макрофаги, полученные из моноцитов, идентифицируются на основе их экспрессии CD 11 B и CD 45. Экспрессия CX3CR1 и Tmem119 средними микроглиальными клетками CD 11 B положительного CD 45 позволяет дополнительно отличить эту популяцию клеток от CD 11 C положительных макрофагов высокого моноцитарного происхождения CD 45, которые не экспрессируют ни один из этих маркеров, но экспрессируют CCR2.

После разделения по градиенту плотности от 85 до 95 процентов клеток все еще жизнеспособны. При отсутствии изоляции градиента плотности субпопуляции макрофагов не могут быть идентифицированы на прямой двусторонней диаграмме рассеяния из-за присутствия немакрофагальных клеток и миелинового мусора. Поскольку эпитоп, распознаваемый антителом против Tmem119, является внутриклеточным, для мечения этого важного маркера микроглиальных клеток требуется пермеабилизация.

Обратите внимание, что пермеабилизация вызывает уменьшение клеток, в результате чего субпопуляции макрофагов кажутся меньше при анализе прямого и бокового рассеяния. После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов, если она выполнена правильно. Хотя я пробовал эту процедуру, важно помнить о очень тщательной настройке градации плотности.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как количественная ОТ-ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы о сигнальных путях субпопуляций макрофагов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению активации субпопуляции макрофагов в мышиной модели неврологических заболеваний. После просмотра этого видео следует либо провести тестирование, либо следовать этой традиции в виде макрофагальных субпопуляций методом проточной цитометрии.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование капюшона.