Количественная оценка плотности ветвлений в клетках грудной железы крысы с полным ходом с использованием метода анализа Sholl

Общая цель данного компьютерного метода заключается в объективной количественной оценке плотности ветвления и затухания ветвления молочной железы — двух важных показателей развития у грызунов — путем применения модифицированного анализа Шолля к изображениям целых препаратов молочных желез. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области биологии молочной железы, например, о том, как воздействие химических веществ может изменить развитие молочной железы. Основным преимуществом данной методики является использование программного обеспечения с открытым исходным кодом для объективной количественной оценки фундаментальных характеристик развития молочной железы.

Для данной процедуры подготовьте изображения целых препаратов, на которых виден железистый эпителий при фиксированном увеличении. Сначала откройте изображение в программе ImageJ. Затем выберите инструмент для свободного рисования (freehand tool).

Обведите железистый эпителий и очистите прилегающую область. Затем обведите лимфатический узел и удалите эту часть изображения с помощью команды вырезания. Если фон изображения черный, его необходимо преобразовать в белый.

Нажмите «Edit» (Правка), затем «Options» (Параметры), затем «Colors» (Цвета). В диалоговом окне выберите белый цвет из выпадающего списка параметров фона. Даже если фон останется черным, при обработке изображения он будет восприниматься как белый.

Теперь разделите цветовые каналы на три восьмибитных полутоновых изображения. Затем выберите канал с наилучшим контрастом, которым обычно является синий канал. После этого вычтите фон из выбранного цветового канала.

Затем выберите необходимые параметры и просмотрите внесенные изменения. В диалоговом окне отметьте «светлый фон» (light background) и активируйте предварительный просмотр, после чего отрегулируйте количество пикселей до достижения желаемого контраста. Если требуется дополнительный контраст, используйте функцию «Нерезкий маск» (Unsharp Mask).

Отметьте пункт «Предпросмотр» (Preview) в диалоговом окне и отрегулируйте радиус пикселей и вес маски до достижения желаемого контраста. После применения фильтра «Контурная резкость» (unsharp mask) удалите границу, созданную этим фильтром. Нажмите кнопку с двойной красной стрелкой на панели инструментов и выберите «Инструменты рисования» (Drawing Tools).

Затем выберите инструмент «Ластик» (Eraser). Отрегулируйте его диаметр, щелкнув правой кнопкой мыши по кнопке инструмента, после чего зажмите левую кнопку мыши, чтобы стереть границу. При стирании доступна только одна операция отмены (Undo), поэтому будьте осторожны.

После применения одного из фильтров удалите оставшиеся шумы вручную. Ориентируясь на копию исходного изображения, удалите выявленные шумы, сначала нажав кнопку с двойной красной стрелкой на панели инструментов и выбрав инструменты рисования. Затем выберите инструмент «ластик».

Отрегулируйте его диаметр, щелкнув правой кнопкой мыши по кнопке инструмента «Ластик». Затем, удерживая левую кнопку мыши, удалите шум. При стирании доступен только один уровень отмены действия, поэтому будьте внимательны.

Затем отрегулируйте порог изображения. Переместите ползунки, чтобы настроить минимальное и максимальное значения порога для улучшения изображения железы. После этого нажмите Apply.

Автоматически удалите дополнительные шумы одним из двух способов. Первый вариант — использовать команду despeckle. Второй вариант — использовать команду remove outliers.

Этот процесс заменяет пиксель медианой его ближайшего окружения только в том случае, если значение пикселя отклоняется от медианы более чем на заданное пользователем пороговое значение. Теперь, используя исходное изображение для сравнения, восстановите участки железистого эпителия, которые были удалены в результате пороговой обработки и удаления шума. При восстановлении изображения действуйте осторожно и в минимально необходимом объеме, чтобы сохранить целостность изображения.

Выберите инструмент «распылитель» (spray can) на панели инструментов для рисования. Щелкните правой кнопкой мыши по кнопке инструмента, чтобы настроить его размер, затем аккуратно закрасьте недостающие участки железы с помощью левой кнопки мыши. После этого создайте скелетизированное изображение железы для проведения Sholl-анализа.

Сначала переведите изображение в бинарный формат. Затем проведите скелетизацию изображения. Этот процесс заключается в многократном удалении пикселей с краев бинарного изображения до тех пор, пока оно не превратится в фигуру шириной в один пиксель.

Теперь выполните однократное расширение изображения, чтобы закрыть разрывы, возникшие в результате пороговой обработки и скелетизации. Затем сохраните изображение в новый файл с помощью команды «Сохранить как». Наконец, проверьте точность скелетированного изображения по сравнению с оригиналом, наложив одно изображение на другое.

В диалоговом окне добавления изображения выберите изображение скелета и установите его непрозрачность на 30%. Затем сохраните наложение как новое изображение для последующего использования. Для начала откройте изображение скелета и преобразуйте его в бинарный формат. Теперь определите масштаб изображения.

Введите количество пикселей на миллиметр, затем установите известное расстояние и коэффициент соотношения сторон пикселя равными единице, выберите миллиметры в качестве единицы длины и переключите глобальную опцию, чтобы применить масштаб ко всем изображениям. Далее, используя инструмент рисования линий, определите конечный радиус для шол-анализа. Проведите линию от начала главного протока до самой дистальной точки железистого эпителия.

Затем нажмите клавишу M, после чего будет выведено значение длины линии. Теперь введите параметры для Sholl-анализа. Сначала в разделе определения оболочек (definition of shells) выберите соответствующие опции, установите начальный радиус на 0.00 millimeters и шаг радиуса на 0.1 millimeters.

Установите количество образцов равным одному. Длина только что проведенной линии будет автоматически введена в поле конечного радиуса. В параметрах выбора нескольких образцов на радиус выберите «mean» (среднее значение) для интегрирования.

Для дескрипторов и параметров криволинейной аппроксимации установите пороговое значение радиуса охвата, равное одному. Для определения количества первичных ветвей выберите опцию «infer from starting radius», а также выберите варианты «linear» и «best fitting degree». Затем в разделе профилей без нормализации («profiles without normalization») выберите «most informative».

Теперь в разделе методов Шолла (sholl methods) выберите «area for normalized profile» (область для нормализованного профиля). В завершение в разделе вывода (output) выберите «create intersections mask» (создать маску пересечений), чтобы построить тепловую карту пересечений. Теперь откройте окно предварительного просмотра изображения с кольцами и подтвердите область анализа.

Если все верно, нажмите «ОК» для запуска анализа. В результате анализа будут созданы окно линейного профиля Шолля, окно полулогарифмического профиля Шолля, окно результатов Шолля, содержащее все выходные значения анализа, и окно с именем файла профилей Шолля, в котором указано количество пересечений при каждом радиусе, определенное с помощью полинома. Для измерения MEA используйте скелетизированное изображение железы в ImageJ.

Откройте инструмент «Многоугольник» (polygon tool) и обведите периметр железы. Добавляйте сегменты линий с помощью щелчков мыши. Когда вся эпителиальная область будет обведена, дважды щелкните левой кнопкой мыши, чтобы замкнуть многоугольник.

Затем нажмите клавишу M, чтобы открыть окно результатов. Значение в столбце area соответствует MEA. Если железистый эпителий распространяется за пределы лимфатического узла, при расчете плотности ветвления вычтите площадь лимфатического узла из MEA.

Площадь лимфатического узла можно измерить таким же образом, как и MEA. С помощью описанных методов были проанализированы две группы крыс соответствующего возраста. Животные в группе B подвергались воздействию химического вещества, вызывающего преждевременное развитие молочных желез.

Построение графика количества пересечений ветвей вдоль радиуса от железы иллюстрирует вариабельность результатов. Результаты Sholl-анализа выявили явное различие в среднем количестве пересечений между группами. Однако для формулирования выводов данные о пересечениях должны быть нормализованы по площади молочной железы.

Шолль-анализ и измерения площади эпителия молочной железы позволяют получить два физиологических параметра, полезных для проведения сравнительного анализа. Очевидно, что размер желез в группе лечения был значительно больше. Шолль-анализ дает значение Sum N, которое используется для расчета плотности ветвления и значения k.

В группе лечения более высокая средняя плотность ветвления и более низкое среднее значение k, отражающее более низкую скорость затухания ветвления, указывают на то, что у леченых животных железы были более развиты, чем у контрольных животных. При выполнении этой процедуры важно помнить, что удаление шума является наиболее критическим этапом. Избыточное или недостаточное удаление шума может нарушить целостность железы и привести к искажению результатов.

При использовании этого метода важно начинать с безупречного цельного препарата молочной железы. Точное скелетизированное изображение невозможно получить при наличии таких дефектов, как разрывы или складки. Создание точного скелетизированного изображения требует терпения и практики.

После освоения данной техники, при условии её правильного выполнения, анализ одной железы занимает от 15 до 20 минут.