Автоматизированные протоколы для высокомолекулярных кристаллизации в MRC лаборатории молекулярной биологии

Общая цель этой процедуры заключается в получении высококачественных кристаллов из исходных условий кристаллизационного грохочения. Кристаллы могут быть использованы для изучения структур белков, ДНК, РНК и их комплексов. Вопрос о макромолекулярных структурах становится все более сложным.

А обеспечение широкого разнообразия начальных условий увеличивает выход полезных кристаллов, одновременно снижая потребность в оптимизации образцов и кристаллов. Две полностью автоматизированные системы, LMB, облегчают подготовку до 1 920 экспериментов по диффузии пара в нанолитровых каплях. Для краткости предполагается, что пользователи уже знакомы с основными функциями и обслуживанием нанолитрового дозатора, струйного принтера и герметика для клеевых пластин.

Перед выполнением процедуры убедитесь, что роботы системы инициализированы и их управляющее программное обеспечение открыто. Включите чиллер трубчатого охлаждающего держателя, примерно за 30 минут до начала основной программы. Поместите тестовую пластину на моторизованный держатель SBS запайщика пластин.

Запустите запайщик пластин и убедитесь, что пленка нанесена правильно. Повторите этот тест еще дважды, чтобы убедиться, что запайщик пластин готов. Затем добавьте 20 литров деионизированной воды в основную емкость обработчика жидкости.

Отсоедините соединительные вставки от меньшего контейнера с 20% раствором для промывки этанолом и подсоедините вставки к основному контейнеру. Введите соответствующее имя экрана на сенсорном экране струйного принтера. Затем откройте и закройте дверцу карусели, чтобы запустить вращение карусели.

Откройте дверцу, когда появится первая стопка. Полностью загрузите первую стопку 22 кристаллизационными пластинами, каждая из которых имеет одну колонну лицевой стороной наружу. Полностью загрузите следующие два стека таким же образом.

Загрузите оставшиеся шесть тарелок в самые высокие позиции четвертой стопки, затем закройте дверцу карулели. Убедитесь, что на дисплее чиллера отображается 14 градусов по Цельсию. Аккуратно и многократно переверните выбранные наборы для скрининга в течение одной минуты.

Затем откройте переднюю панель обработчика жидкостей. Откройте трубки и поместите их в охлаждающий держатель в стандартной 96-луночной схеме. Поместив каждую пробирку в держатель, поместите ее крышку на лоток в той же схеме на 96 лунок.

При использовании системы 1 провода для этикеток размещаются на лотке в 96-луночной схеме, чтобы можно было проверить правильность расположения пробирок. Перепроверьте положение трубок, а затем убедитесь, что все трубки выровнены и установлены в держателе. Затем закройте переднюю панель.

В окне «Запуск» программного обеспечения для обработки жидкостей выберите «Запустить техническое обслуживание» и откройте программу «Промывка». Запустите программу, чтобы смыть 20%-ный этанол из системы и промыть снаружи дозирующие наконечники жидкости. Когда сброс будет завершен, нажмите кнопку Отмена, чтобы вернуться к запуску.

Выберите «Запустить существующий процесс» и нажмите «Начать выбор». Откройте программу выдачи MRC Kit. Заполните поле 18"для экземпляров на экране конфигурации и запустите программу, контролируйте систему, пока первые четыре пластины помечены, заполнены и запечатаны.

Не оставляйте систему без присмотра до тех пор, пока не будет завершена подготовка первых четырех пластин. После того, как все 72 пластины будут подготовлены и помещены обратно в карусель, переключите соединительные вставки с контейнера с деионизированной водой на контейнер с 20% этанолом. Запустите программу сброса при запуске, используя тот же процесс, что и раньше.

Выключите чиллер и выбросьте пустые пробирки с просеивающим комплектом. Аккуратно выньте из карусели 72 подготовленные тарелки. Выбросьте неправильно заполненные или плохо запечатанные пластины.

Храните готовые к использованию тарелки при температуре 10 градусов Цельсия. Сначала убедитесь, что роботы системы включены, нанолитровый дозатор инициализирован с открытым программным обеспечением, а диспетчер методов обработчика жидкостей открыт. Включите держатель охлаждения микротрубок примерно за 15 минут до запуска основной программы.

Поместите тестовую пластину на моторизованный держатель SBS запайщика пластин. Запустите запайщик пластин и убедитесь, что пластина правильно запечатана. Проверьте запайщик пластин три раза.

Затем запустите нанолитровый дозатор, чтобы установить 100 нанолитровых капель тестового раствора в тестовую пластину. Здесь показана световая микрофотография 100-нанолитровой капли, полученной с помощью нанолитрового дозатора, с тестовым раствором, изготовленным с красным красителем. Закройте программу дозатора нанолитров и снимите блок держателя полосы с деки.

Затем в специально разработанный держатель планшета устанавливается предварительно заполненный 96-луночный кристаллизационный планшет с самым высоким относительным количеством летучих реагентов в его условиях. Снимите клейкую пленку с тарелки. Откройте переднюю панель погрузчика жидкостей и поместите негерметичную пластину на палубу в задней части первого раздвижного носителя.

Накройте тарелку алюминиевой крышкой SBS. Установите крышку по направлению к заднему левому углу переноски, слегка надавливая на противоположный угол крышки. При использовании Системы 2 в первую очередь следует обрабатывать скрининговые наборы со значительными количествами летучих реагентов.

Это позволяет избежать образования конденсата на выводах SBS, что может привести к автоматическому перемещению выводов или герметизации пластин. Распечатайте, загрузите в скользящие держатели и закройте оставшиеся 19 пластин таким же образом, работая от наиболее к наименее взрывоопасным условиям. Как только держатель охлаждения микротрубки достигнет 4 градусов Цельсия, как указано зеленым светом, снимите его крышку.

Срежьте крышку микропробирки, содержащей не менее 440 микролитров образца белка. Следите за тем, чтобы в образце не было пены над мениском, так как это будет мешать работе системы обнаружения жидкости. Поместите трубку в положение 1 держателя для охлаждения микротрубок.

Поместите планшет для ПЦР на деку погрузчика жидкостей перед держателем адаптера для перемещения пластины. Затем закройте переднюю панель. В интерфейсе управления методами обработки жидкостей выберите Настроить пластины.

Контролируйте инициализацию обеих систем и заполните параметры прогона, включая тип пластины и количество капель для каждого условия, размер капли, положение первой обрабатываемой пластины и количество пластин. Нажмите «Нет», когда вас спросят, нужна ли вам помощь в загрузке колоды. Убедившись, что пустых полок для чаевых нет, нажмите OK. Убедившись, что советов достаточно для пробежки, нажмите OK. При необходимости обновите систему управления чаевыми и нажмите OK. Убедитесь, что дека дозатора с нанолитрами свободна от блока держателя полосы, а держатель находится в задней части стеков наконечников объемом 50 микролитров, не имеет алюминиевых крышек SBS.

Убедитесь, что все остальные необходимые компоненты готовы, а затем начните процесс. Следите за работой системы, пока нанолитровый дозатор устанавливает капли в первой пластине, а затем запечатыватель пластин запечатывает пластину. Не оставляйте систему без присмотра до тех пор, пока не будет завершена подготовка первой пластины.

После того, как все 20 пластин будут подготовлены кристаллизационными каплями и автоматически вернутся на скользящие держатели, откройте переднюю панель и аккуратно снимите пластины. Перед хранением для кристаллизации убедитесь, что пластины правильно запечатаны. Очистите крышки SBS 20%-ным раствором этанола перед тем, как уложить их на левую сторону манипулятора для хранения жидкостей.

Выбросьте ПЦР-планшет и микропробирку. Выключите держатель для охлаждения микротрубок и сотрите конденсат. Оставьте бумажное полотенце поверх поверхности холодильника, чтобы впитать дальнейший конденсат.

Затем установите на место крышку несущей державы и закройте переднюю панель. Первоначально скрининг OmpF и MreB проводился с использованием этих полностью автоматизированных протоколов. Кристаллы OMPF достаточного качества для рентгеновской дифракции были обнаружены в лунке А4 пластины LMB 7.

Дифракционные качественные кристаллы MreB были обнаружены в лунке D12 пластины LMB 20. Хранение пластин перед заправкой топливом при температуре 10 градусов Цельсия является компромиссом, позволяющим избежать замерзания и хранения при температуре 4 градуса, что может привести к ухудшению условий кристаллизации и проблемам, связанным с конденсацией. При таком хранении тарелки можно использовать в течение четырех-пяти месяцев.

От 4 до 8 000 пластин ЛКМ ежегодно производятся с помощью системы 1 и затем используются для первичного грохочения. Протоколы следует оптимизировать по-другому, когда ожидаемый оборот значительно ниже. Весь наш набор пластин для предварительного заправки обычно используется в качестве большого начального экрана для нового образца.

Тем не менее, можно выбрать меньшее количество пластин в соответствии с более специфическими требованиями к образцам. После приготовления капель тарелки хранятся на полках с низким уровнем вибрации при строго контролируемой температуре 4 или 18 градусов по Цельсию. Эксперименты оцениваются с помощью спиральных источников света.

После тщательного изучения природы кристаллов признаки и сходства между условиями могут быть проанализированы с помощью веб-инструментов, таких как базы данных LMB или C6 Screen. Последующая оптимизация условий кристаллизации все еще может быть необходима. Дополнительные автоматизированные протоколы с использованием 4-угольных методов и аддитивного скрининга описаны в нашей рукописи.