Использование Immunolabeling для анализа стабильной, динамичной и зарождающейся микротрубочек в Zebrafish эмбриона

Общая цель этих процедур мечения заключается в визуализации и количественном определении стабильных, динамичных и зарождающихся микротрубочек в развивающемся эмбрионе рыбки данио. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии развития, такие как вклад микротрубочек в установление полярности клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он оптимизирует обнаружение и количественную оценку отдельных популяций микротрубочек in situ.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за трудностей в поддержании целостности микротрубочек. После дехлорирования этапных эмбрионов данио-рерио согласно текстовому протоколу переложите их в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров, удалив как можно больше среды. Добавьте один миллилитр 4% PFA в буфер для сборки микротрубочек или MAB, чтобы зафиксировать эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия на пять минут.

Затем с помощью пипетки отсасывайте фиксатор и замените его одним миллилитром свежего фиксатора. Выдержите сампели на коромысле при комнатной температуре в течение трех часов. Отсадите фиксатор и добавьте один миллилитр буфера TBS NP-40.

Аккуратно взбалтывайте зародыши на качалке в течение пяти минут. Повторите стирку еще два раза. Затем, заменив буфер на один миллилитр свежего TBS NP-40, храните эмбрионы при температуре четыре градуса Цельсия не более семи дней.

После де-йолкинга и встраивания эмбрионов в агарозу согласно текстовому протоколу, поставить разделительную чашку, заполненную TBS NP-40, с помощью вибратома создать 40 микрометров сечения самого высокого доступа к агарозе внедренных эмбрионов. Используйте тонкие щипцы для переноса интересующих срезов до 500 микролитров TBS NP-40 в 24-луночный планшет. Снимите буфер, и добавьте 500 микролитров раствора для блокировки.

Затем покачивайте секции при комнатной температуре не менее одного часа. Замените блокирующий раствор 300 микролитрами первичных антител, разведенных в блокирующем буфере, и инкубируйте образцы на коромысле при температуре четыре градуса Цельсия в течение 36-72 часов. Используйте 600 микролитров TBS NP-40 для двукратной промывки образцов.

Ставим их на качалку комнатной температуры на 30 минут каждая. Добавьте в срезы 300 микролитров флуорофорных конъюгированных вторичных антител, разведенных в блокирующем буфере, и инкубируйте их в темноте на коромысле при температуре четыре градуса Цельсия в течение 16-24 часов. Затем промойте образцы дважды, как только что продемонстрировано.

Далее добавьте к эмбрионам 500 микролитров раствора DAPI и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем с помощью TBS NP-40 промыть образцы три раза при комнатной температуре в течение пяти минут. После промывки капните каплю монтажной среды с антивыцветающим средством на центр непыльного предметного стекла.

С помощью тонких щипцов перенесите секции на каплю монтажной среды. Затем наденьте сверху на образец непыльную крышку. Храните предметные стекла, завернутые в фольгу, в сухом, темном и прохладном месте до тех пор, пока не будет выполнена визуализация.

Используя детали, изложенные в текстовом протоколе, захватите конфокальные изображения z стека с настройками каналов для выбранных флуорофоров вторичных антител и сохраните файлы изображений. С помощью программного обеспечения для 3D-анализа, такого как Image J, откройте копию файла данных. Создайте объединенное изображение, наложив интересующие каналы путем выбора изображения, цвета, объединения каналов.

Выберите каналы 594 нм, 488 нм и DAPI, которые будут окрашены в красный, зеленый и синий цвета соответственно. Проверяем, создаем композит и выбираем, хорошо. Визуализируйте объединенный стек z в виде одного 2D-изображения, выполнив проекцию максимальной интенсивности стека z с помощью проекта images, stack, z.

Введите начальную и конечную позиции внутренних лучших z-плоскостей в качестве начального слайда и стоп-среза соответственно. Выберите максимальную интенсивность в качестве типа проекции и нажмите OK. В программном обеспечении для 3D-анализа выберите, создайте библиотеку и укажите описательное имя для библиотеки изображений.

Нажимайте, создавайте и перетаскивайте необработанные файлы изображений в библиотеку. Далее выберите файл для анализа. Затем в меню просмотра выберите «Расширенный фокус», чтобы отобразить объединенное изображение канала в главном окне.

Выберите инструмент ROI от руки и наметьте область интереса для анализа. Выберите вкладку «Действия», а затем «Обрезать до выбора», чтобы обрезать изображение. Затем сохраните обрезанный файл изображения под новым именем.

Затем перейдите на вкладку измерений, чтобы создать протокол для фильтрации конкретных объектов, имеющих отношение к 3D-анализу. Затем перетащите объекты в окно протокола и переименуйте первый протокол в DAPI. Выберите канал бета-тубулина в выпадающем меню.

Затем перетащите следующие настройки в протокол бета-тубулина и поместите их ниже, чтобы найти объекты в следующем порядке. Заполняйте отверстия и объекты, разделяйте соприкасающиеся объекты, исключайте объекты по размеру и исключайте рентабельность инвестиций, не касающихся. Теперь выберите, измерьте в нижней части каждого протокола.

Затем для всех каналов, кроме DAPI, выберите измерение интенсивности и объема, а также длину скелета для всех мечений тубулинов. Нарисуйте ROI по региону, который нужно измерить. На вкладке «Сводка» можно наблюдать за измерениями после того, как программное обеспечение обработает регион.

Затем скопируйте данные и сохраните их в рабочей электронной таблице, как показано здесь. Чтобы построить многолуночный проточный аппарат, с помощью кондуктора или ленточной пилы разделите центрифугу объемом 50 миллилитров пополам в продольном направлении. Из капроновой сетки толщиной 70 микрометров вырезаем семь полукругов радиусом три сантиметра и обрезаем их так, чтобы они плотно входили в одну половину разбитой центрифужной пробирки.

Используя безопасный для аквариума силиконовый герметик, приклейте полукруги в центрифужную трубку параллельно 10 миллилитровой градации маркировки. Дав устройству высохнуть в течение двух дней, промойте его, замочив в стакане с водой на два-три часа. Выстелите верхний резьбовой конец вырезанной центрифужной трубки пластилином для лепки таким образом, чтобы высота жидкости, удерживаемой в проточном устройстве, составляла одну четверть дюйма.

Подготовьте промывочный аппарат, вынув поршень из 50-миллилитрового шприца и вставив 12 дюймов тонкой трубки в наконечник. Вставьте трубку как можно дальше и используйте пластилин для герметизации вокруг соединения. В случае с зародышевой средой предварительно намочите сетку, чтобы жидкость прошла через весь поток устройства.

Наклоните устройство на льду так, чтобы жидкость втягивалась во все отсеки, но при этом опорожнялась спереди, где находится глиняная поля. Подвесьте промывочный аппарат на кольцевой подставке над проточным устройством на льду. Охладите 200 миллилитров зародышевой среды на льду и налейте достаточное количество в промывочный аппарат, чтобы убедиться, что все пузырьки воздуха очищены, а скорость потока составляет примерно семь миллилитров в минуту.

Отрегулируйте скорость потока, изменяя высоту шприца. После дехлорирования эмбрионов и приготовления нокодазола согласно текстовому протоколу используют 10 миллилитров холодного рабочего раствора нокодазола для замены эмбриональной среды группы обработки нокодазолом. Поместите чашки Петри на лед на время, подходящее для стадии развития.

Затем с помощью отполированной на миллилитровом стеклянной пипетке огня перенесите эмбрионы в поток через аппарат с использованием отдельных отсеков для каждой опытной группы. Начните вымывание нокодазола, налив в верхнюю часть шприца объемом 50 миллилитров ледяную зародышевую среду. Дайте микротрубочкам отрасти после 20 минут промывания при комнатной температуре, используя отполированную огнем стеклянную пипетку объемом один миллилитр для переноса эмбрионов в стеклянные чашки Петри, содержащие теплую среду для эмбрионов.

Как только эмбрионы будут перенесены, запустите таймер. Наконец, зафиксируйте контрольные и вымытые эмбрионы через одну, пять и 10 минут путем пипетирования примерно 10 эмбрионов в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, заполненную одним миллилитром фиксатора 4% PFA MAB, и зафиксируйте образцы, как показано ранее в этом видео. Использование глу-тубулина и тубулина tyr в качестве маркеров стабильных и динамических микротрубочек.

Показано, что динамические микротрубочки = преобладают в заднем мозге на стадии нейронного убийства. По мере того, как килл развивается в нервный стержень, что является стадией усиленной эпителизации, качественно меньшее количество микротрубочек является иммунореактивным с антителами против тир-тубулина, особенно в вентральном стержне. Напротив, глу-тубулин рассеивается и точечно по всему нейронному киллу, но обогащается в вентральном нервном стержне по ходу микротрубчатого тракта.

Стрелки указывают на конкретные пучки микротрубок или структуры, в которых маркировка увеличена. Обработка нокодазолом деполимеризует микротрубочки, что приводит к обездвиживанию мечения. По мере того, как микротрубочки отрастают, они отходят от центросомы.

Однако это может быть не очевидно в одной плоскости из-за их неплоских траекторий. Тем не менее, некоторые программы для анализа изображений способны измерять длину в 3D, что позволяет оценить рост микротрубочек после вымывания нокодазола. Средняя длина микротрубочек, по-видимому, увеличивается с течением времени после вымывания нокодазола во всех анализируемых областях нервной трубки.

После того, как анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа 3D-изображений завершен и качество контролируется, из необработанных данных может быть извлечена полезная информация, такая как средняя длина общих микротрубочек и стабильных микротрубочек с отношением стабильных микротрубочек к общему количеству микротрубочек. После освоения эта техника занимает не более недели от начала до конца. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о своевременном сборе и обработке образцов, так как микротрубочки легко деполимеризуются.

Эта процедура также может быть применена к анализу мутантов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как захватывать различные популяции микротрубочек в интактном эмбрионе.