Микрокристаллизация кристаллов белков и

Общая цель данного протокола — представить методологии рентгеновской кристаллографии, применяемые к микрокристаллам, и в особенности к тем, которые образуются в клетках и считаются кристаллами in vivo. Основным преимуществом этого подхода является обеспечение простого и эффективного процесса получения, обнаружения и анализа микрокристаллов. Данный метод направлен на облегчение использования микрокристаллов за счет применения кристаллов, выращенных внутри живых клеток, что исключает необходимость в сложных процессах очистки и проб на седиментацию Aprocox.

В этом видео мы сосредоточимся на простых методах подготовки и манипулирования образцами для экспериментов по рентгеновской дифракции на синхротронном излучении. Мы покажем этапы, которые наиболее существенно отличаются от классической кристаллографии. В данной демонстрации мы будем использовать кристаллы белка витального полиэдра, выращенные в успехе, однако этот метод может быть применен и к белкам, образующим кристаллы в любых бактериальных, насекомых, млекопитающих или дрожжевых клетках.

Сначала инкубируйте 30 мл клеток Sf9, гиперэкспрессирующих белок полиэдра циповируса, в течение трех дней при 27 °C на ротаторе. Перенесите 500 µL культуры клеток Sf9 в микроцентрифужную пробирку с помощью стерильной серологической пипетки, соблюдая стерильность основной культуры путем работы в боксе биологической безопасности II класса и соблюдения стандартных правил асептики. Пипеткой перенесите 5 µL суспензии клеток из микроцентрифужной пробирки на предметное стекло.

Затем осторожно наклоните стеклянное покровное стекло над образцом так, чтобы один его край касался капли, и аккуратно опустите его на жидкость, избегая образования пузырьков воздуха. После этого снимите изображение предметного стекла с помощью инвертированного микроскопа. Внимательно изучите клетки, начиная с 200-кратного увеличения, и перейдите к максимальному увеличению при обнаружении потенциального кристалла.

Проверьте наличие острых краев и изменений рефрактивности. При обнаружении кристаллов ежедневно осматривайте культуру, повторяя предыдущие шаги для мониторинга роста кристаллов. Для клеток Sf9 проведите сбор, перенеся культуру в центрифужную пробирку.

Поместите пробирку на лед и как можно скорее переходите к следующему шагу. Для выделения клеток, содержащих кристаллы, перенесите пипеткой 4 mL инфицированных клеток Sf9 в пробирку, предназначенную для проточного цитометрического анализа. Подготовьте вторую пробирку с эквивалентным количеством клеток Sf9 из ложноинфицированной культуры в качестве контроля.

Затем, непосредственно перед анализом методом проточной цитометрии, добавьте пропидийиодид в оба образца до конечной концентрации 1 µg/mL. Далее поместите клетки контрольного образца в стандартный проточный цитометр с функцией сортировки клеток по параметрам FSC и SSC. Проанализируйте не менее 20 000 событий.

После исключения из анализа мертвых клеток, клеточных агрегатов и клеточного дебриса постройте график FSC в зависимости от SSC. Затем проанализируйте не менее 20 000 событий в образце, содержащем кристаллы. Сравните график FSC против SSC с контролем и определите появление отдельной популяции, соответствующей клеткам с кристаллами.

Определите гейты вокруг популяции клеток, содержащих кристаллы, которая обычно характеризуется более высокими значениями SSC или FSC. Используя данный гейтинг, отсортируйте примерно 150 000–200 000 клеток, содержащих кристаллы, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, предварительно заполненную 50 µL буфера PBS. Выполните визуализацию отсортированных образцов с помощью световой микроскопии, как описано ранее, чтобы подтвердить, какая популяция соответствует клеткам, содержащим кристаллы.

На этом этапе клетки могут быть инкубированы с растворами тяжелых атомов, если требуется экспериментальное определение фаз. Данный подход предполагает предварительный скрининг различных соединений и времени инкубации, как описано в тексте и в других обзорах. Подготовьте инструменты для монтажа образца, закрепив микросетку на штифте на конце магнитного стержня.

Поместите стержень боком в выемку поплавка для диализа. Затем с помощью пинцета возьмите бумажный фитиль и зафиксируйте его. Перед продолжением работы убедитесь, что установка собрана полностью.

Теперь смешайте клетки с равным объемом 0.4% раствора trypan blue до конечной концентрации 0.2%. После ресуспендирования клеток перенесите пипеткой 0.5 µL отсортированных клеток на микросетку. После того как клетки осядут на поверхность микросетки, удалите большую часть излишков жидкости, промакивая их бумажным фитилем. Если микросетка будет просушена недостаточно, клетки окажутся на разной глубине в излишках жидкости, что затруднит их совмещение с рентгеновским пучком на синхротроне.

Кроме того, избыток жидкости приведет к усилению фонового рентгеновского рассеяния. При чрезмерном промакивании микросетки жидкость удалится полностью, и образец не будет удерживаться в отверстиях решетки. При оптимальном промакивании на микросетке остается лишь тонкий слой жидкости, который защищает образец и способствует его попаданию в отверстия решетки.

Некоторым кристаллам потребуется использование криопротектора. В нашем случае это не обязательно, но процедура будет такой же, как при нанесении образца и последующем промакивании. Убедитесь, что остался лишь тонкий слой жидкости.

Немедленно подвергните микросетку быстрому охлаждению в жидком азоте и перенесите ее в робот-держатель (puck) для транспортировки на линию микрофокусированного пучка синхротрона. В связи с малым размером кристаллов, полученных in vivo, соберите данные о дифракции на линии микрофокусированной кристаллографии. Сначала установите микросетку на гониометр.

Теперь начните с центрирования микросетки относительно пути пучка, используя ориентацию «лицом» (face-on) и «сбоку» (side-on). При ориентации микросетки «лицом» выполните точную настройку, совместив центр одной из горизонтальных дорожек микросетки с центром пучка. Соберите данные вдоль этой горизонтальной дорожки, внося лишь незначительные корректировки в юстировку.

После того как все кристаллы в дорожке будут протестированы, перейдите к следующей дорожке и повторите процедуру юстировки. Убедитесь, что обработанные дорожки четко обозначены, чтобы не пропустить кристаллы и не подвергнуть их повторному облучению, используя в качестве индикатора изменение цвета трипанового синего. Представлен обзор двух методов определения структуры с использованием микрокристаллов in vivo.

Верхний ряд описывает классический подход, включающий очистку кристаллов из клеток, в то время как нижний ряд демонстрирует подход кристаллографии in cellulo, при котором кристаллы остаются в клетках-хозяевах для сбора данных. Для подхода in cellulo профиль проточной цитометрии неинфицированных клеток сравнивается с профилем клеток, содержащих кристаллы, и используется для определения того, какая популяция клеток должна быть выбрана для отсортирования клеток с кристаллами от остальных клеток. В данном примере клетки, содержащие полиэдры, имеют более высокий показатель бокового рассеяния, чем неинфицированные клетки.

Клетки, окрашенные трипановым синим, можно легко визуализировать с помощью камер, доступных на большинстве линий синхротронного излучения. Поскольку очищенные кристаллы из-за их малого размера трудно идентифицировать и совместить с рентгеновским лучом, при сборе данных лучше всего двигаться по сеточному шаблону, чтобы свести к минимуму процедуры центрирования и избежать повторного облучения одной и той же клетки или кристалла, а также пропускать клетки и кристаллы. После освоения данный рабочий процесс занимает около половины дня — от сбора клеток, содержащих кристаллы, до сбора данных.

Данная процедура совместима с замачиванием в растворах тяжелых атомов для экспериментального определения фаз. В случае с многогранником нормальная структура была получена через восемь дней с начала экспрессии белка. Не забывайте, что работа с жидким азотом может быть крайне опасной, поэтому необходимо принять меры предосторожности для предотвращения удушья и ожогов.