Name: Микрокристаллизация кристаллов белков и Разное Дифракция (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Узнайте методы рентгеновской кристаллографии микрокристаллов белков, выращенных в живых клетках. Этот подход упрощает анализ, устраняя сложную очистку, и демонстрирует эксперименты на синхротроне.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы хотели бы отметить Chan-Sien Lay для предоставления снимков очищенных микрокристаллов, Даниэля Эрикссона и Тома Карадока-Дэвиса для поддержки на линии луча MX2 австралийского синхротрона, а также Кэтрин Фланаган и Эндрю Фриги из объекта FlowCore в Университете Монаш для их Неоценимую помощь.

<ol><li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 0(2014).</li>
<li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li>
<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="https://elifesciences.org/articles/01345">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2 (0), e01345(2013).</li>
<li>Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/0889311X.2010.527964">Macromolecular microcrystallography.</a> Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).</li>
<li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-crystallography+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/CH/CH14455">Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography.</a> Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cypovirus+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cypovirus polyhedra.</a> Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+baculovirus+polyhedra+reveals+the+independent+emergence+of+infectious+crystals+in+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).</li>
<li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+photosynthetic+reaction+centre+determined+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451(2015).</li>
<li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li>
<li>Gallat, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers%3A+the+next+generation+of+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).</li>
<li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li>
<li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+%C3%85+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li>
<li>Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359029405000956">Protein crystallization in vivo.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Bombyx+mori+cytoplasmic+polyhedrosis+virus+polyhedrin+in+insect+cells+by+using+a+baculovirus+expression+vector%2C+and+its+assembly+into+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra.</a> J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).</li>
<li>Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Virus-like+Particles+for+Vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Production+and+Purification+of+Recombinant+Murine+Kindlin-3+from+Insect+Cells+for+Biophysical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Berger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MultiBac+Protein+Complex+Production+Platform+at+the+EMBL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
<li>Margine, I., Palese, P., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Functional+Recombinant+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Proteins+from+the+Novel+H7N9+Influenza+Virus+Using+the+Baculovirus+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Khurana, A., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+For+Production+of+Recombinant+mCD1d+Protein+in+Insect+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.</a> J Vis Exp. (10), (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Baskaran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+cellulo-derived+structure+of+PAK4+in+complex+with+its+inhibitor+Inka1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1.</a> Nat Comm. 6, 1-11 (2015).</li>
<li>Armour, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+Parallel+Processing+Approach+for+Gene-to-structure+Determination+of+the+Influenza+Polymerase+PB2+Subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).</li>
<li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?a15572">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).</li>
<li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li>
<li>Rey, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virology%3A+holed+up+in+a+natural+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Virology: holed up in a natural crystal.</a> Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).</li>
<li>Schönherr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+investigation+of+dynamic+protein+crystallization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells.</a> Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).</li>
<li>Hasegawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallization+of+human+IgG+in+the+endoplasmic+reticulum+of+engineered+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells.</a> J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463(2016).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
<li>Nass, K. <a target="_blank" href="NULL">Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers</a>. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Этот протокол предусматривает два подхода к анализу микрокристаллов с целью облегчения анализа очень мелких кристаллов, которые в прошлом бы упускались из виду. Критические этапы очистки микрокристаллов Представленный протокол оптимизирован с использованием многогранника Bombyx mori CPV1, выраженного в клетках Sf9, в качестве модельной системы. Однако в микрокристаллах in vivo наблюдается большая изменчивость в механической устойчивости. Нап...

Использование рентгеновской кристаллографии для определения структур с высоким разрешением биологических макромолекул наблюдалось устойчивое прогрессирование в течение последних двух десятилетий. Растущее поглощение рентгеновской кристаллографии неспециалистскими исследователями иллюстрирует демократизацию этого подхода во многих областях наук о жизни 1 . Исторически кристаллы с размерами менее ~ 10 мкм считались сложными, если не непригодными для определения структуры. Растущая доступность выделенных микрофокусных лучей для источников синхротронного излучения во всем мире и технологических достижений, таких как разработка инструментов для управления микрокристаллами, устранила большую часть этих барьеров, что затихло широким использованием рентгеновской микрокристаллической системы. Достижения в серийной рентгеновской микрокристаллографии 2 , 3 и дифракции микроэлектронов 4 гаПоказали, что использование микро- и нанокристаллов для определения структуры не только осуществимо, но и иногда предпочтительнее использования крупных кристаллов 5 , 6 , 7 . Эти достижения были впервые применены к изучению пептидов 8 и природных кристаллов, продуцируемых вирусами насекомых 9 , 10 . Они теперь используются для широкого круга биологических макромолекул, включая самые сложные системы, такие как мембранные белки и большие комплексы 11 . Чтобы облегчить анализ этих микрокристаллов, они были проанализированы в мезо , в частности мембранных белках 12 и микрочипах микрожидкостей 13 . Наличие этих новых методологий микрокристаллизации повысило возможность использования вVivo как новый путь для структурной биологии 14 , 15 , 16, предлагающий альтернативу классическому кристаллогенезу in vitro . К сожалению, даже когда кристаллы in vivo могут быть получены, остается несколько препятствий, таких как деградация или потеря лигандов во время очистки от клеток, трудности в манипулировании и визуализации кристаллов на синхротронной пучке и утомительные эксперименты по дифракции рентгеновских лучей. В качестве альтернативных кристаллов также анализировали непосредственно внутри клетки без какой-либо стадии очистки 17 , 18 , 19 . Сравнительный анализ показывает, что такие в подходах целлюлозы могут быть более эффективными, чем анализ очищенных кристаллов и получение данных с более высоким разрешением 20 . Этот протокол находится вКак правило, помогали исследователям, новым для микрокристаллизации белка. Он предоставляет методологии, ориентированные на подготовку проб и манипулирование экспериментами рентгеновской дифракции на синхротронной пучке. Предлагаются два варианта использования изолированных кристаллов для классической микрокристаллической или кристаллически-содержащих клеток, отсортированных по проточной цитометрии для целлюлитного анализа ( рис. 1 ).

<table><tbody><tr><td>Sf9 cells</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM среда для насекомых</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>колба для клеточной культуры 1 л</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking инкубатор для культуры клеток насекомых</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 мл конические пробирки</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge с качающимися ведрами на 50 мл трубки</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator оснащены 19 мм зондом</td><td>MSE Soniprep 150&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Предметные стекла</td><td>Hampton Research Гемацитометр</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Пропидиум йодид</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Influx сортировщик клеток&nbsp;</td><td>Атомные экраны BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Heavy</td> Микроцентрифуга <td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Микроцентрифуга</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25 имеют большую поверхность. Индексированные сетки можно приобрести для проведения систематических исследований.</td></tr><tr><td>Бумажный фитиль</td><td>Mitigen</td><td></td><td>Размер бумажного фитиля можно варьировать для обеспечения оптимального потока. Во многом это будет зависеть от характера используемых кристаллов и криопротектора.</td></tr><tr><td>Этиленгликоль</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 микрофокусная линия излучения</td><td>Австралийский синхротрон</td><td></td><td>Список доступных микрофокусных линий пучков можно найти в Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash; 1806, doi:10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

Микрокристаллизация кристаллов белков и<em&gt; Разное</em&gt; Дифракция

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Появление высококачественных линий микрофокусировки на многих синхротронных объектах позволило провести обычный анализ кристаллов размером менее 10 мкм в их наибольшем измерении, который использовался для представления проблемы. Мы представляем два альтернативных рабочих процесса для определения структуры микрокристаллов белка с помощью рентгеновской кристаллографии с особым упором на кристаллы, выращенные in vivo . Микрокристаллы либо экстрагируют из клеток обработкой ультразвуком, либо очищают путем дифференциального центрифугирования, либо анализируют в целлюлозе после сортировки клеток с помощью проточной цитометрии кристаллосодержащих клеток. Необязательно, очищенные кристаллы или кристаллосодержащие клетки пропитываются в растворах тяжелых атомов для экспериментальной фазировки. Эти образцы затем подготавливают для дифракционных экспериментов аналогичным образом путем нанесения на подложку с микрометом и мгновенного охлаждения в жидком азоте. Кратко описываем и сравниваем серийные дифракционные эксперименты изолированных микрокристаллов и кристалло-Содержащих микрофокусную синхротронную лучевую линию для создания наборов данных, подходящих для фазирования, построения моделей и их доработки. Эти рабочие процессы иллюстрируются кристаллами полиэдрина Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1), полученным путем заражения клеток насекомых рекомбинантным бакуловирусом. В этом случае исследование в целлюлозном анализе более эффективно, чем анализ очищенных кристаллов, и дает структуру через ~ 8 дней от экспрессии до измельчения.

Представлен обзор обоих альтернативных методов определения структуры с использованием микрокристаллов in vivo ( рис. 1 ). Полиэдры могут быть легко очищены ультразвуком и центрифугированием. Из-за их плотности они образуют слой в нижней части трубки под слоем мусора, который может быть удален путем пипетирования ( рис. 3а и 3b ). Затем образец подвергают нескольким раундам обработки ультразвуком и промы...

Протокол представлен для рентгеновской кристаллографии с использованием микрокристаллов белка. Сравниваются два примера, анализирующие in vivo- выращенные микрокристаллы после очистки или в целлюлозе .

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Общая цель данного протокола — представить методологии рентгеновской кристаллографии, применяемые к микрокристаллам, и в особенности к тем, которые образуются в клетках и считаются кристаллами in vivo. Основным преимуществом этого подхода является обеспечение простого и эффективного процесса получения, обнаружения и анализа микрокристаллов. Данный метод направлен на облегчение использования микрокристаллов за счет применения кристаллов, выращенных внутри живых клеток, что исключает необходимость в сложных процессах очистки и проб на седиментацию Aprocox.В этом видео мы сосредоточимся на простых методах подготовки и манипулирования образцами для экспериментов по рентгеновской дифракции на синхротронном излучении. Мы покажем этапы, которые наиболее существенно отличаются от классической кристаллографии. В данной демонстрации мы будем использовать кристаллы белка витального полиэдра, выращенные в успехе, однако этот метод может быть применен и к белкам, образующим кристаллы в любых бактериальных, насекомых, млекопитающих или дрожжевых клетках.Сначала инкубируйте 30 мл клеток Sf9, гиперэкспрессирующих белок полиэдра циповируса, в течение трех дней при 27 °C на ротаторе. Перенесите 500 µL культуры клеток Sf9 в микроцентрифужную пробирку с помощью стерильной серологической пипетки, соблюдая стерильность основной культуры путем работы в боксе биологической безопасности II класса и соблюдения стандартных правил асептики. Пипеткой перенесите 5 µL суспензии клеток из микроцентрифужной пробирки на предметное стекло.Затем осторожно наклоните стеклянное покровное стекло над образцом так, чтобы один его край касался капли, и аккуратно опустите его на жидкость, избегая образования пузырьков воздуха. После этого снимите изображение предметного стекла с помощью инвертированного микроскопа. Внимательно изучите клетки, начиная с 200-кратного увеличения, и перейдите к максимальному увеличению при обнаружении потенциального кристалла.Проверьте наличие острых краев и изменений рефрактивности. При обнаружении кристаллов ежедневно осматривайте культуру, повторяя предыдущие шаги для мониторинга роста кристаллов. Для клеток Sf9 проведите сбор, перенеся культуру в центрифужную пробирку.Поместите пробирку на лед и как можно скорее переходите к следующему шагу. Для выделения клеток, содержащих кристаллы, перенесите пипеткой 4 mL инфицированных клеток Sf9 в пробирку, предназначенную для проточного цитометрического анализа. Подготовьте вторую пробирку с эквивалентным количеством клеток Sf9 из ложноинфицированной культуры в качестве контроля.Затем, непосредственно перед анализом методом проточной цитометрии, добавьте пропидийиодид в оба образца до конечной концентрации 1 µg/mL. Далее поместите клетки контрольного образца в стандартный проточный цитометр с функцией сортировки клеток по параметрам FSC и SSC. Проанализируйте не менее 20 000 событий.После исключения из анализа мертвых клеток, клеточных агрегатов и клеточного дебриса постройте график FSC в зависимости от SSC. Затем проанализируйте не менее 20 000 событий в образце, содержащем кристаллы. Сравните график FSC против SSC с контролем и определите появление отдельной популяции, соответствующей клеткам с кристаллами.Определите гейты вокруг популяции клеток, содержащих кристаллы, которая обычно характеризуется более высокими значениями SSC или FSC. Используя данный гейтинг, отсортируйте примерно 150 000–200 000 клеток, содержащих кристаллы, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, предварительно заполненную 50 µL буфера PBS. Выполните визуализацию отсортированных образцов с помощью световой микроскопии, как описано ранее, чтобы подтвердить, какая популяция соответствует клеткам, содержащим кристаллы.На этом этапе клетки могут быть инкубированы с растворами тяжелых атомов, если требуется экспериментальное определение фаз. Данный подход предполагает предварительный скрининг различных соединений и времени инкубации, как описано в тексте и в других обзорах. Подготовьте инструменты для монтажа образца, закрепив микросетку на штифте на конце магнитного стержня.Поместите стержень боком в выемку поплавка для диализа. Затем с помощью пинцета возьмите бумажный фитиль и зафиксируйте его. Перед продолжением работы убедитесь, что установка собрана полностью.Теперь смешайте клетки с равным объемом 0.4% раствора trypan blue до конечной концентрации 0.2%. После ресуспендирования клеток перенесите пипеткой 0.5 µL отсортированных клеток на микросетку. После того как клетки осядут на поверхность микросетки, удалите большую часть излишков жидкости, промакивая их бумажным фитилем. Если микросетка будет просушена недостаточно, клетки окажутся на разной глубине в излишках жидкости, что затруднит их совмещение с рентгеновским пучком на синхротроне.Кроме того, избыток жидкости приведет к усилению фонового рентгеновского рассеяния. При чрезмерном промакивании микросетки жидкость удалится полностью, и образец не будет удерживаться в отверстиях решетки. При оптимальном промакивании на микросетке остается лишь тонкий слой жидкости, который защищает образец и способствует его попаданию в отверстия решетки.Некоторым кристаллам потребуется использование криопротектора. В нашем случае это не обязательно, но процедура будет такой же, как при нанесении образца и последующем промакивании. Убедитесь, что остался лишь тонкий слой жидкости.Немедленно подвергните микросетку быстрому охлаждению в жидком азоте и перенесите ее в робот-держатель (puck) для транспортировки на линию микрофокусированного пучка синхротрона. В связи с малым размером кристаллов, полученных in vivo, соберите данные о дифракции на линии микрофокусированной кристаллографии. Сначала установите микросетку на гониометр.Теперь начните с центрирования микросетки относительно пути пучка, используя ориентацию «лицом» (face-on) и «сбоку» (side-on). При ориентации микросетки «лицом» выполните точную настройку, совместив центр одной из горизонтальных дорожек микросетки с центром пучка. Соберите данные вдоль этой горизонтальной дорожки, внося лишь незначительные корректировки в юстировку.После того как все кристаллы в дорожке будут протестированы, перейдите к следующей дорожке и повторите процедуру юстировки. Убедитесь, что обработанные дорожки четко обозначены, чтобы не пропустить кристаллы и не подвергнуть их повторному облучению, используя в качестве индикатора изменение цвета трипанового синего. Представлен обзор двух методов определения структуры с использованием микрокристаллов in vivo.Верхний ряд описывает классический подход, включающий очистку кристаллов из клеток, в то время как нижний ряд демонстрирует подход кристаллографии in cellulo, при котором кристаллы остаются в клетках-хозяевах для сбора данных. Для подхода in cellulo профиль проточной цитометрии неинфицированных клеток сравнивается с профилем клеток, содержащих кристаллы, и используется для определения того, какая популяция клеток должна быть выбрана для отсортирования клеток с кристаллами от остальных клеток. В данном примере клетки, содержащие полиэдры, имеют более высокий показатель бокового рассеяния, чем неинфицированные клетки.Клетки, окрашенные трипановым синим, можно легко визуализировать с помощью камер, доступных на большинстве линий синхротронного излучения. Поскольку очищенные кристаллы из-за их малого размера трудно идентифицировать и совместить с рентгеновским лучом, при сборе данных лучше всего двигаться по сеточному шаблону, чтобы свести к минимуму процедуры центрирования и избежать повторного облучения одной и той же клетки или кристалла, а также пропускать клетки и кристаллы. После освоения данный рабочий процесс занимает около половины дня — от сбора клеток, содержащих кристаллы, до сбора данных.Данная процедура совместима с замачиванием в растворах тяжелых атомов для экспериментального определения фаз. В случае с многогранником нормальная структура была получена через восемь дней с начала экспрессии белка. Не забывайте, что работа с жидким азотом может быть крайне опасной, поэтому необходимо принять меры предосторожности для предотвращения удушья и ожогов.

microcrystallography-of-protein-crystals-and-in-cellulo-diffraction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Биохимия

Оценка двумерных (2D) испытания кристаллизации для формирования упорядоченных массивов мембранный белок является очень важные и трудные задачи в электронной кристаллографии. Здесь мы описываем наш подход в скрининге и идентификации 2D-кристаллы преимущественно небольшие мембранные белки в диапазоне 15 - 90kDa.

Оценка Двумерные Кристаллизация Испытания малых мембранных белков для структурных исследований биологии электронным кристаллографии

В этой статье описывается методология криоэлектронной микроскопии, которая используется для получения высококачественных микроскопических изображений макромолекул в их близком к нативному состоянии. Этот метод позволяет получить изображения, пригодные для дальнейшей компьютерной обработки с использованием подхода с использованием одной частицы, разработанного для создания 3D-реконструкции макромолекулы.

И что нельзя делать крио-электронной микроскопии: учебник по пробоподготовки и высокое качество сбора данных для высокомолекулярных 3D реконструкции

Этот протокол описывает подробно в изготовлении и эксплуатации microfluidic приборы для сбора данных рентгеновской дифракции при комнатной температуре. Кроме того он описывает, как контролировать кристаллизации белка путем динамического рассеяния света, и как обрабатывать и анализировать полученные данные дифракции.

Microfluidic чипы для In Situ кристалл рентгеновской дифракции и на месте Динамическое рассеяние света для последовательного кристаллографии

В этой статье подробно измышления протокола микрофлюидных чипов, разработанных для  кристаллизации белка на чипе с помощью метода диализа и экспериментов по рентгеновской дифракции на месте. Процесс микрофабрикации позволяет интегрировать полупроницаемую регенерируемую целлюлозную диализную мембрану с любым молекулярным вырезом веса, между двумя слоями чипа.

Кристаллизация белков на чипе с помощью микродиализа для рентгеновских исследований In Situ

Здесь мы описываем разработанные в нашей лаборатории процедуры получения порошков низкомолекулярных кристаллов для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED).

Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул

Определение структуры высокомолекулярных комплексов с помощью криоЭМ стало рутиной для определенных классов белков и комплексов. Здесь этот конвейер обобщается (подготовка образцов, скрининг, сбор и обработка данных), и считыватели направляются к более подробным ресурсам и переменным, которые могут быть изменены в случае более сложных образцов.

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Липидные монослои использовались в качестве основы для формирования двумерных (2D) белковых кристаллов для структурных исследований на протяжении десятилетий. Они стабильны на границе раздела воздух-вода и могут служить тонким поддерживающей материалом для электронной визуализации. Здесь мы представляем проверенные этапы подготовки липидных монослоев для биологических исследований.

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

В этом вкладе описывается, как настроить кристаллизацию белка на кристаллических устройствах и как выполнять автоматизированный последовательный сбор данных при комнатной температуре с использованием платформы кристаллизации на кристалле.

Кристаллизация на кристалле и крупномасштабная последовательная дифракция при комнатной температуре

Крио-ЭМ карты макромолекул с высоким разрешением также могут быть получены с помощью микроскопов TEM 200 кВ. Этот протокол демонстрирует лучшие практики для установки точных оптических выравниваний, схем сбора данных и выбора областей изображения, которые необходимы для успешного сбора наборов данных высокого разрешения с использованием ТЕА 200 кВ.

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Представленный протокол описывает простой подход к скринингу условий кристаллизации белка и роста кристаллов с использованием 96-луночной высокопроизводительной диализной пластины. Использование трубок-диализаторов для крупномасштабного выращивания микрокристаллов также продемонстрировано для серийной кристаллографии и приложений MicroED.

Высокопроизводительная кристаллизация белка с помощью микродиализа

Узнайте методы рентгеновской кристаллографии микрокристаллов белков, выращенных в живых клетках. Этот подход упрощает анализ, устраняя сложную очистку, и демонстрирует эксперименты на синхротроне.

Микрокристаллизация кристаллов белков и

Больше видео