Гипоксическое предварительное кондиционирование клеток-предшественников, полученных из костного мозга, в качестве источника для генерации зрелых клеток Шванна

Общая цель этого метода культивирования клеток заключается в обогащении нейронных предшественников костного мозга, чтобы облегчить их дифференцировку в функциональные шванновские клетки. Этот метод решает ключевую проблему в области стволовых клеток и регенеративной медицины: как использовать ограниченный источник нейропредшественников для создания глии, способствующей посттравматическому росту аксонов и ремиелинизации. Преимуществом этого метода является использование эффективного кондиционирования культур для облегчения роста нервных клеток из стромальных клеток костного мозга для их использования в аутологичной клеточной терапии.

После двух дней в культуре удалите 75% отработанной среды и неадгезивные клетки и промойте адгезивные клетки тремя 10-миллиметровыми промывками PBS. После третьего промывки замените PBS на 10 миллилитров костного мозга стомальных клеток, или МСК, питательной среды и верните культуру в инкубатор. Видимые колонии должны появиться к шестому-седьмому дню.

На 10-й день промойте культуру в свежем PBS и отделите клетки 1,5 мл рекомбинантного реагента для диссоциации ферментативных клеток. Через пять минут при температуре 37 градусов Цельсия добавьте три миллилитра питательной среды MSC, чтобы нейтрализовать реакцию и собрать оторвавшиеся клетки путем центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах свежей питательной среды MSC и засейте клетки в соотношении от четырех до 10 до 4 клеток на квадратный сантиметр в новую 10-сантиметровую тканальную культуральную пластину.

Клетки должны достичь конфлюенции от 80 до 90% в течение двух дней после пассирования. Для гипоксического предварительного кондиционирования сначала отпустите кольцевой зажим и очистите открытые детали 70% этанолом. Далее разберите камеру гипоксии на составляющие и поместите их в ламинарный проточный колпак для стерилизации под ультрафиолетовым излучением в течение 15 минут.

Затем промойте культуру с конфлюенцией от 80 до 90% конфлюентной МСК с 10 мл PBS, как только что было показано, и обработайте культуры свежей питательной средой МСК с добавлением 25 миллимолярных гепесов. Поместите обработанную культуру в собранную камеру гипоксии и затяните кольцевой зажим. Загерметизируйте соединительные концы камеры, чтобы убедиться в отсутствии утечки газа, и смойте в камеру газовую смесь из 99% азота и 1% кислорода со скоростью потока 10 литров в минуту.

Через пять минут поместите камеру в инкубатор для клеточных культур на 16 часов. На следующее утро отделите клетки, как показано только что на рисунке, и соберите их с помощью центрифугирования. Ресуспендируйте гранулу в нейропрогениторной среде и семени шесть раз по 10 до 3 клеток на квадратный сантиметр на 6-луночных планшетах с низким уровнем прикрепления для их культивирования при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 12 дней.

Значительные неадгезивные сферы клеток должны наблюдаться к шестому-седьмому дню. С большим количеством нейросфер, проявляющихся в гипоксии, обусловливали культуры, чем те, кто находился при нормоксиии к 10-12 дням. На 12-й день с помощью пипетки объемом 10 миллилитров перенесите нейросферы в коническую трубку объемом 15 миллилитров и соберите нейросферы с помощью центрифугирования.

Ресуспендируйте сферы в DMEM/F12 и наложите от 5 до 10 нейросфер на квадратный сантиметр на поли-D-лизиновый ламинин, покрыв 6 луночных планшетов в 1,5 миллилитрах глиальной индукционной среды на лунку. Выдерживайте культуру сферических клеток не менее семи дней, обновляя среду каждые три дня. Чтобы извлечь ганглии заднего корня, перенесите первый эмбрион в 10-сантиметровую чашку для культивирования, содержащую PBS комнатной температуры, под микроскопом для препарирования в положении лежа и вставьте микрощипцы для рассечения по обе стороны спинного мозга.

С помощью тупого рассечения отделите спинной мозг от окружающих мягких тканей с помощью щипцов, чтобы иссечь спинной мозг вдоль шейного отверстия и хвостового отрезка. Удалите остаточные мягкие ткани из освобожденного спинного мозга до тех пор, пока не останутся только спинной мозг, нервные корешки и прикрепленный ганглий дорсального корешка. Отделите отдельные ганглии дорсальных корешков от их соединительных нервных корешков.

Затем с помощью пипеточной ручки, оснащенной наконечником для пипетки объемом один миллилитр, перенесите до 100 ганглиев дорсальных корешков в микроцентрифужную пробирку PBS объемом 1,5 миллилитров. Соберите ганглии центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах рекомбинантного реагента для ферментативной диссоциации клеток на пробирку. Через 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия снова центрифугируйте ганглии дорсального корешка с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров, чтобы аккуратно растирать гранулы в среде для поддержания нейронов ганглия дорсального корня.

Засейте ганглиозные клетки дорсального корешка в соотношении от пяти до 10 до 3 клеток на квадратный сантиметр на поли-D-лизиновом ламинине, покрытом 6 лунками, в 1,5 миллилитрах среды для поддержания нейронов ганглиозов дорсального корешка на лунку. После двух дней в культуре при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 промойте клетки и верните культуры нейронных клеток в инкубатор в свежей среде для очистки нейронов ганглиозов дорсального корня еще на два дня. После трех-четырех циклов поддержания и очистки культуры ганглиозных клеток дорсального корешка должны дать положительный результат на нейрональный маркер Tuj-1 и отрицательный результат на маркер глиальных клеток S100 beta.

На седьмой день работы шванновской клеточной культуры промывают клетки в PBS с последующей диссоциацией 0,5 мл рекомбинантного реагента для ферментативной диссоциации клеток в лунку при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в среду для совместной культивирования и высадите шванновские клетки, похожие на клетки, на очищенную культуру ганглиозных нейронов дорсального корня в количестве от 10 до 30 клеток на квадратный сантиметр в течение 14 дней совместного культивирования при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Здоровые МСК демонстрируют коническую морфологию в отличие от четырехугольного вида МСК, которые сохранялись в течение большого числа пассажей и утратили свою мультипотенцию.

Расширенные колонии МСК должны демонстрировать экспрессию маркеров МСК, отсутствие маркеров гемопоэтических стволовых клеток и способность к дифференцировке в адипогенные, остеогенные и хондрогенные линии. Здоровая культура МСК, которая была подвергнута гипоксическому прекондиционированию, демонстрирует нейросферы, которые больше как по количеству, так и по размеру. Чистота нейронной сети ганглия дорсального корешка может быть подтверждена экспрессией нейронального маркера Tuj-1 и сопутствующим отсутствием маркера шванновских клеток S100.

После 14 дней в совместном культивировании с ганглиозными нейронами дорсальных корешков, шванновские клетки, подобные клеткам, приобретают черты и функциональные свойства зрелых шванновских клеток, обреченных на судьбу. После освоения субпопуляция нейронных предшественников может быть расширена в BMSC человека или крысы за 10 дней, если техника клеточной экспансии выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о том, что образец BMSC наделен нестин-положительными нейропредшественниками, а все CD45-положительные гемопоэтические предшественники были удалены.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получать BMSC, обогащать субпопуляцию нейронных предшественников и направлять дифференцировку нейронных предшественников в шванновские клетки, совершенные судьбой, для использования в усилении посттравматического восстановления аксонов и ремиелинизации. После этой процедуры могут быть получены миелинизирующие глии, такие как зрелые шванновские клетки, для их использования в разработке методов лечения демиелинизирующих травм и заболеваний как периферической, так и центральной нервной системы.