Разделение молочных желез всех мест для идентификации поражения

Общая цель этой процедуры заключается в создании высококачественных окрашенных срезов из цельной ткани молочной железы мыши для идентификации поражения на микроскопическом уровне. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с оценкой молочных желез, такие как гистопатологическая идентификация типов поражений, выявленных в целых холмиках молочной железы. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она увеличивает шанс выявления поражений, которые могут существовать внутри молочных желез при использовании цельных смонтированных тканей.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы сравнили целые фенотипы гор с гистопатологическими отчетами о том, что филлин подходит для окрашивания H и E контрлатеральных желез у одних и тех же животных. Мы увидели расхождение в диагнозах, больше поражений было видно в целых горах. Визуальная демонстрация этого метода важна, так как все этапы снятия крепления и встраивания имеют решающее значение для успеха этой процедуры.

Железа нежная из-за своей тонкой рыхлой природы. После подготовки образцов памяти всего монтирования и анализа ткани на аномалии в соответствии с текстовым протоколом, удалите защитные стекла и монтажный материал, погрузив стекла в стеклянную банку для окрашивания, наполненную ксилолом. Инкубируйте в течение ночи или дольше.

Перенесите предметные стекла в свежий ксилол и замочите образцы на шесть часов. Затем снова перенесите образцы в свежий ксилол и замочите на ночь. Затем рукой в перчатке удерживайте предметное стекло и с помощью пары щипцов аккуратно снимите покровное стекло целиком.

Легкость снятия покровного стекла может варьироваться в зависимости от толщины монтажного материала и времени, прошедшего с момента установки покровного стекла в целом. Поэтому крайне важно, чтобы предметное стекло оставалось в ксилоле до тех пор, пока покровное стекло не будет легко отпущено. После снятия покровного стекла используйте острое одноразовое лезвие бритвы, чтобы извлечь образец, сдвинув лезвие одним движением вниз по предметному стеколу.

Затем быстро погрузите блокнот памяти в заполненную ксилолом стеклянную чашку Петри, чтобы убедиться, что ткань не высохнет на воздухе. Используйте бритву, чтобы разрезать более крупные ткани пополам. Затем, чтобы свести к минимуму повреждение тканей, используйте щипцы с тупым носом и зазубренным наконечником, чтобы захватить край жировой подушки, и поместите половинки лицевой стороной вверх в две отдельные маркированные кассеты, которые будут соответствовать размеру ткани.

Поместите кассету в контейнер с ксилолом на срок до двух часов, прежде чем поместить ее в тканевый процессор. Затем загрузите максимальное количество кассет в тканевый процессор вручную. Прежде чем начать, запрограммируйте процессор для обработки тканей.

Чтобы автоматизировать процедуру, выберите станцию, температуру и вакуум включите вкл. Автоматизируйте процессор, чтобы замочить кассеты в ксилоле на 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия с последующим вторым замачиванием в свежем ксилоле в тех же условиях. Затем автоматизируйте процессор, чтобы извлечь кассеты из раствора ксилола и перенести ткани в камеру внутри процессора, содержащую смесь ксилола и расплавленного парафина, установленную при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Когда все шаги будут выполнены, нажмите «ОК» или «Начните продолжать». Поместите кассеты в резервуар для хранения парафиновой ванны при температуре 58 градусов Цельсия до готовности поместить их в форму. Снимите крышки кассет, чтобы определить наилучший размер пресс-формы для салфеток.

Добавьте три-четыре миллиметра расплавленного парафина из носика в форму, затем сориентируйте ткань в расплавленном парафине так, чтобы вся поверхность монтировки молочной железы, которая примыкала к нижней части предметного стекла и дну кассеты, была обращена вверх в форме. Перенесите форму на охлаждающую пластину и быстро отрегулируйте ткань по мере необходимости, чтобы она была параллельна дну формы. С помощью щипцов плотно поместите маркированную кассету поверх формы.

Непрерывным движением нанесите в форму дополнительный расплавленный парафин, чтобы покрыть всю кассету. Переместите форму с теплой пластины на холодную пластину, чтобы обеспечить фиксацию в точном положении, выбранном для секционирования. Когда парафиновый блок полностью застынет, отделите блок от формы.

И храните его при комнатной температуре до готовности к разделке. Перед разделкой парафиновые блоки инкубируют при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем приготовьте микротом, включив водяную баню, содержащую свежую дистиллированную воду, и отрегулируйте температуру до 42 – 45 градусов по Цельсию.

Далее поместите на микротом свежее низкопрофильное лезвие и установите его на четыре микрометра. Вставьте блок в микротом так, чтобы воск был обращен к лезвию и выровнен по вертикальной плоскости. Затем смочите участок марлевой салфетки в холодной воде и положите ее на колодку на несколько минут.

Секционируйте блок, поворачивая большое колесо по часовой стрелке в сочетании с колесом с ходом, пока не получится полное или репрезентативное сечение блока. Затем перенесите участок ткани вручную на ванну с теплой водой, прежде чем использовать чистое предметное стекло, чтобы поднять его. Поместите предметные стекла на кронштейн для сушки, чтобы удалить лишнюю воду.

Затем храните срезы ткани при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. После извлечения предметных стекол из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия храните их при комнатной температуре до тех пор, пока они не будут готовы к окрашиванию. Для автоматического окрашивания выберите H и E в параметрах окрашивания в главном меню, чтобы окрасить слайды.

Депарафинизация, окрашивание и обезвоживание выполняются на автоматической морилке. Для крепления секций используйте монтажный носитель и покровное стекло. Для определения идеальной толщины ткани молочной железы были подготовлены срезы на четыре микрометра и шесть микрометров.

Четыре микрометровых среза дали оптимальные результаты, в которых эпителиальные и стромальные области и соответствующие типы клеток были легко различимы. Эти цифры представляют собой гистологические участки нормальных желез. Обе железы демонстрируют протоковые структуры, окруженные крепкой и однородной популяцией, богатой адипоцитами.

Каждый проток выстлан одним слоем простых кубовидных эпителиальных клеток и поддерживается вторым слоем базальных клеток. Контралатеральные целые монтировки содержали область повышенной непрозрачности, которая включала протоки желез памяти. Тем не менее, было неясно, было ли помутнение результатом гиперпластического, воспалительного или неопластического изменения.

Здесь показаны контралатеральные цельные крепления. Эти отделы были диагностированы как периваскулярное воспаление из-за повышенного количества лимфоцитов вокруг крупного кровеносного сосуда в отделе молочных желез. В этих образцах дольковая архитектура молочной железы была сохранена, но увеличена за счет увеличения количества и размера нормальных альвеол и протоков для лобулярной альвеолярной гиперплазии.

Увеличенные дольки содержали увеличенное количество альвеол и протоков, которые были выстланы хорошо дифференцированными, часто вакуолизированными эпителиальными клетками, которые образовывали просветы, содержащие белковую жидкость. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что ткань хрупкая из-за ксилола и она может легко сломаться, разрушив образец. Прежде чем пробовать этот метод, рекомендуется сделать высококачественные фотографии целых креплений с помощью планшетного сканера.

Это возможность для области токсикологической патологии продвинуться в направлении комплексной оценки для химического скрининга. Таким образом, когда поражения выявляются на этом уровне, теперь можно получить высококачественные срезы для гистопатологической диагностики. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как удалять, встраивать и рассекать молочные железы целиком для идентификации поражения.

Не забывайте, что при работе с ксилолом следует носить такие меры предосторожности, как лабораторные халаты и перчатки, а работа должна проходить под капюшоном.